IFN-γ释放试验(T-SPOT.TB)在结核病诊断中的应用

IFN-γ释放试验(T-SPOT.TB)在结核病诊断中的应用

孔令和，柯云霞，高素香，杨剑，雷桂萍，史国香，黄洁

【摘 要】摘要：目的 探讨T淋巴细胞感染结核后IFN-γ释放斑点试验(T-SPOT.TB)在结核病诊断中的应用及价值。方法 采用T-SPOT.TB方法对疑诊或待排结核患者外周血液中释放IFN-γ的结核杆菌特异性淋巴细胞的测定。结果 T-SPOT.TB方法的阳性率是83.1%(89/107)，结核菌素试验(tuberculin skin test,TST)的阳性率40.2%(43/107)，涂片找抗酸杆菌阳性率是25.6%(21/82)，TB-DNA的阳性率是9.4%(5/53)，分枝杆菌分离培养阳性率是21.4%(9/42)。结论 T-SPOT.TB方法检测诊断结核性疾病敏感性为83.1%、特异性为95.2%；其阳性率明显高于TST、涂片找抗酸杆菌、TB-DNA、分枝杆菌分离培养，采用该方法检测T淋巴细胞感染结核IFN-γ释放快速敏感，特异性高，在结核性疾病诊断中具有重要价值。 【期刊名称】实验与检验医学 【年(卷),期】2013(000)006 【总页数】3

【关键词】结核病;T-SPOT.TB检测;IFN-γ;特异性;敏感性

结核病是一种严重危害人民健康的慢性传染病，据WHO统计，全球有约20亿人感染结核分枝杆菌，每年约为200万死于结核病[1]。我国是世界上仅次于印度的第2个结核病大国，结核感染率为44.5%，活动性结核患者450万，每年死亡人数达13万[2]。目前在结核病方面，临床实验室常用检测的方法是有：涂片抗酸染色法、培养法、实时荧光PCR(TB-DNA)检测、结核抗体和结核菌素试验等。由于涂片抗酸染色阳性率低，结核分枝杆菌培养的检测时间较长等

原因，都无法很好地服务于临床。所以寻求准确、快速、可靠的诊断结核病方法非常重要。

近年来研究表明IFN-γ是抗结核感染免疫中的关键细胞因子[3]，主要由激活的T淋巴细胞在结核特异性抗原刺激下产生。T-SPOT.TB诊断实验以BCG以及大多数环境分枝杆菌中均缺失，仅存在于堪萨斯分枝杆菌及海分枝杆菌等少数环境分枝杆菌中的RD1基因合成的抗原靶-6(ESAT-6)及蛋白-10(CFP-10)作为刺激抗原[4],结核分枝杆菌感染外周血单个核淋巴细胞(PBMC)中存在结核特异性T细胞，T淋巴细胞受到结核杆菌特异性抗原刺激后分泌IFN-γ。我们应用此方法对临床患者相关标本进行了检测，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 标本来源 收集我院自2012年11月至2013年5月在肺、呼吸两科住院疑诊或待排结核病的患者，共273例，资料较完整有169例，其中男性115例，女性54例，年龄在2~81岁，平均年龄为55.3岁。进行了T-SPOT.TB方法检测。

1.2 试剂和仪器

1.2.1 T-SPOT.TB试剂盒，淋巴细胞分离液、AIM、RPM1640培养液由上海长征复星公司提供。

1.2.2 美国Thermo Formo生物安全柜、Galaxy Rs-Biotech CO2孵育箱、Neofuge 1600R型台式高速水平离心机、

1.3 原理 T-SPOT.TB技术是利用结核分枝杆菌感染外周血单个核淋巴细胞(PBMC)中存在结核特异性T细胞，这个T淋巴细胞受到结核杆菌特异性抗原刺激后分泌IFN-γ。PBMC和结核特异的混合抗原A(ESAT-6)和混合抗原

B(CFP-10)与对照试剂一起加入预包被干扰素抗体的微孔板进行培养孵育。当PBMC中存在特异性T细胞时，培养液中加入的结核分枝杆菌特异混合抗原多肽A和多肽B将刺激其分泌。分泌的IFN-γ被微孔板上的抗IFN-γ捕获，再次加入的碱性磷酸酶标记抗体与被捕获的IFN-γ相结合，滞留在微孔板上，加入显色底物溶液在反应部位形成不溶性色素沉着斑点。每1个斑点代表1个结核分枝杆菌致敏的T淋巴细胞，根据斑点数可以判断体内是否存在针对结核分枝杆菌反应的效应T淋巴细胞，并可计数T细胞的数量。

1.4 方法 (1)采集4ml外周血置于肝素钠抗凝的试管中(2管)，立即混匀，在4h内进行单个核细胞(PBMC)分离。(2)离心管中预先加入4mlRPM1640培养液，将混匀的8ml抗凝全血加入离心管中，混匀。(3)另取一离心管预先加入4ml淋巴细胞分离液，将混匀的细胞悬液缓慢加入淋巴细胞分离液上方，经1600g离心22min,再用吸管吸取白细胞层到15ml的离心管中。(4)再加入RPM1640培养液至10ml,600g离心7min,弃去上清液。(5)再加RPM1640培养液至10ml,400g离心7min,弃去上清液。(6)加0.5ml AIM培养液，充分混匀。取10μl细胞悬液于40μl台盼兰中混匀，再用细胞计数板充池计数(或直接使用血球仪计数)。每份标本用AIM培养液配制为2.5×109个/L，再取出T-SPOT.TB试剂盒内微孔反应板，每个样本按 (阴性对照、A抗原、B抗原、阳性对照)的顺序加入相应的50μl试剂，然后每空加入100μl细胞稀释工作液后孵育，37℃，5%CO2，16~20h， 用 pH6.8~7.2 的 PBS 洗板。加入碱性磷酸酶标记的抗人IFN-γ单克隆抗体50μl,2~8℃孵育1h。再用PBS液洗板，最后每孔加显色液50μl。避光室温静置7min，用蒸馏水冲洗后观察结果。并用电子放大镜观察记录斑点数。