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动物免疫学实验指导
第二版
徐春厚 为天 雍艳红 编 动物医学 生物技术专业用
海洋大学教材科出版 二00七年二月二十八日 文档Word
目 录
实验一凝集试验………………………………………………………1
沉淀试验………………………………………………………实验二
4 实验三溶血试验………………………………………………………8
10 实验四………………………………病毒的血凝及血凝抑制试验 E-玫瑰花环试验 实验五……………………………………………13 EA……………………………………………实验六 15 玫瑰花环试验 EAC玫瑰花环试验……………………………………………17实验七 …………………………………………18 实验八酶联免疫吸附试验
实验九………………………………………………20 荧光抗体技术 多克隆抗体（免疫血清）的制备实验十 22 …………………………
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实验一 凝集试验
颗粒性抗原(细菌、螺旋体、红细胞等)与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，抗原颗粒可相互凝集成肉眼可见的凝集块，称为凝集反应(Agglutination reaction)或凝集试验。参与凝集反应的抗原称为凝集原（Agglutinogen），抗体称为凝集素（Agglutinin）。
细菌或其它凝集原都带有相同的负电荷，在悬液中相互排斥而呈现均匀的分散状态。抗原与相应抗体相遇后可以发生特异性结合，形成抗原抗体复合物，降低了抗原分子间的静电排斥力，此时已有凝集的趋向，在电解质（如生理盐水）参与下，由于离子的作用，中和了抗原抗体复合物外面的大部分电荷，使之失去了彼此间的静电排斥力，分子间相互吸引，凝集成大的絮片或颗粒，出现了肉眼可见的凝集反应。根据是否出现凝集反应及其程度，对待测抗原或待测抗体进行定性、定量测定。
凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类，本实验主要介绍直接凝集反应。 [目的要求]
1. 掌握平板凝集试验和试管凝集试验的操作方法。 2. 掌握凝集试验的结果判定及判定标准。
3. 熟悉平板凝集试验和试管凝集试验所需材料和试剂。 [材料与试剂]
1. 玻板，载玻片，试管（1cm x 8cm），试管架，刻度吸管，滴管，微量可调加样器，滴头（tip头），牙签或火柴棒，记号笔。
2. 灭菌的生理盐水，灭菌的0.5%石炭酸生理盐水。
3. 布氏杆菌病试管凝集抗原，布氏杆菌病平板凝集抗原，布氏杆菌病虎红平板凝集抗原，布氏杆菌病阳性血清，布氏杆菌病阴性血清，被检血清（牛、羊或猪）。
4. 鸡白痢平板凝集抗原，鸡白痢阳性血清，鸡白痢阴性血清，被检鸡血清。 [实验容及操作方法] （一）试管凝集试验
以牛布氏杆菌病试管凝集试验为例。
1. 试管准备：每份血清用试管4支，另取3支试管作为对照，作好标记，置试管架上。如被检血清有多份，对照只需做1份。
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2. 被检血清稀释：第1管加入2.3 ml 0.5% 石炭酸生理盐水，第2、3、4管加入0.5 ml 0.5% 石炭酸生理盐水；然后用加样器或刻度吸管吸取被检血清0.2 ml ，加入第1管中，反复吹吸5次混匀，吸取1.5 ml 弃之，再吸取0.5 ml 加入第2管中，混匀后吸取0.5 ml 加入第3管，依此类推至第4管，混匀后吸弃0.5 ml （见表1-1）。该被检血清的稀释度分别是1:12.5、
1:25、1:50、1:100。
3. 对照管制作：第5管中加0.5% 石炭酸生理盐水0.5 ml ，第6管加1:25稀释的布氏杆菌病阳性血清0.5 ml ，第7管加1:25稀释的布氏杆菌病阴性血清0.5 ml 。
4. 加抗原：将布氏杆菌病试管凝集抗原用0.5% 石炭酸生理盐水作1:20稀释，每支试管加0.5 ml 。
表1-1 布氏杆菌病试管凝集试验术式表（单位：ml） 12345 67
最终血清稀释25阴性血50阳性血100200 2525
0.50.50.50.5石炭酸生理盐0.52.3 0.50.50.50.20.5被检血0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 20) (抗0.5 0.5
0.51.5 弃弃5. 感作（反应）：7支试管加完抗原后，充分混匀，置于37℃温箱中4-10h，取出后置室温18-24h（或37℃温箱12-14h，取出后置室温2-4h；或37℃温箱中22-24 h取出），然后观察并记录结果。
6. 结果判定：判定结果时用“+”表示反应的强度。根据各管中上清液的透明度、抗原被凝集的程度及凝集块的形状，来判定凝集反应的程度。
＋＋＋＋：100％抗原凝集，上清液完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底，振荡时，沉淀物呈片状、块状或颗粒状。
＋＋＋：75％抗原凝集，上清液略呈混浊，菌体大部分被凝集沉于管底，振荡时情况如上。（管底凝集物与100%凝集时相同，只是上清液稍浑浊）。
＋＋：50％抗原凝集，上清液浑浊半透明，管底有中等量的凝集物（管底有明显的凝集）。 ＋：25％抗原凝集，上清液完全浑浊不透明，管底有少量凝集物或凝集的痕迹。
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－：抗原完全未凝集，上清液完全浑浊不透明，但由于菌体的自然下沉，在管底中央出现规则的菌体自沉圆点，振荡后立即散开呈均匀混浊。
7. 判定标准：能使50% 抗原凝集的血清最高稀释度称为该血清的凝集价（或称滴度）。 牛、马和骆驼的血清凝集价大于或等于1:100，判为阳性，1:50的凝集价判为疑似反应（可疑）；猪、绵羊、山羊和狗的血清凝集价大于或等于1:50，判为阳性，1:25的凝集价判为疑似反应（可疑）。 [注意事项]
1. 实验时必须设抗原、阳性血清及阴性血清对照，以避免假阳性、假阴性的结果。 2. 结果判为可疑时，隔2-3周后采血重做。阳性畜群，重检时仍为可疑，可判为阳性。对同群中既无临床症状又无凝集反应阳性者，马、猪重检仍为可疑，判阴性；牛、羊重检仍为可疑者，可判为阳性，或以补体结合反应核对。
（二）布氏杆菌病平板凝集试验
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微?L），并注明被检血清，以1001. 加血清：取洁净玻板一块，用蜡笔划成方格（4cm4、第?L20?L、
第3格2量可调加样器按下列量加被检血清于方格，第l格80?L、第格40 头。℃左右。每一份检样需换一个tip10?L。血清用前需放室温，使其温度达20格；猪、山?L ?L 和2040大规模检疫时，允许只用两个血清量作试验，牛、马、骆驼用 L。和40?羊、绵羊、狗用80?L，滴在血清附近，而不与血清接触。L加抗原：每格加布氏杆菌病平板凝集抗原30?2.
从血清量最少的一格起，用牙签将血清与抗原混匀，一份血清用一根牙签。 ℃左右。抗原用前摇匀，并置室温使其温度达20℃303. 作用：混和完毕后，将玻板置恒温箱中或采用别的办法适当加温，使温度达到 3-5min记录反应结果。左右， 4. 对照：每次试验须用标准阳性血清和阴性血清以及生理盐水作对照。 结果判定：按下列标准记录反应结果。5. 凝集。＋＋＋＋：出现大的凝集块，液体完全透明，即100%
75% 凝集。＋＋＋：有明显凝集块，液体几乎完全透明，即 凝集。＋＋：有可见凝集块，液体不甚透明，即50%
25% 凝集。＋：液体混浊，有小的颗粒状物，即 －：液体均匀混浊，无凝集现象。 4 6. 平板凝集试验与试管凝集试验的关系见表1-2。 表1-2 平板凝集试验与试管凝集试验的关系
L ??L 10?L 40?L 20凝平 板 集 80 1:200 1:50 1:25
相当于试管凝集 1:100
7. 判定标准：同试管凝集试验。
8. 注意：对于阳性及可疑的被检血清需用试管凝集试验进行验证。 （三）虎红平板凝集试验
这种试验是快速平板凝集试验。抗原是布氏杆菌加虎红制成。虎红平板凝集试验可与试管凝集试验及补体结合试验效果相比，具有操作简单、快速、特异性强的优点。
1. 被检血清和布氏杆菌病虎红平板凝集抗原各30?L滴于玻璃板的方格，每份血清各用一支牙签或火柴棒混合均匀。在室温（20℃）4-10min记录反应结果。同时以阳、阴性血清作对照。 2. 结果判定：在阳性血清及阴性血清试验结果正确的前提下，被检血清出现任何程度的凝集现象均判为阳性，完全不凝集的判为阴性，无可疑反应。
3. 注意：抗原用前充分摇匀，抗原和被检血清用前应放室温30-60min后再进行试验。 （四）鸡白痢平板凝集试验
1. 被检鸡血清和鸡白痢平板凝集抗原各1滴（约30?L）滴于玻板或载玻片上，用牙签或火柴棒充分混合。
2. 结果判定：在室温（20℃）下，观察30-60s，凝集者为阳性，不凝集者为阴性。
[思考题]
1. 凝集反应的原理是什么? 2. 哪些因素影响细菌凝集试验?
3. 凝集试验中为什么要设阳性、阴性血清及抗原对照？
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