A549DDP细胞凋亡与其机制的研究

由天下分享时间：2024/11/24 2:13:40 加入收藏我要投稿点赞

A549/DDP细胞凋亡及其机制的研究

1材料 1.1主要仪器

荧光显微镜及照相系统：Olympus公司垂直电泳槽：Bio-Rad公司电转移槽：Bio-Rad公司恒温摇床：江苏太仓仪器公司分光光度仪：Bio-Rad公司遥控酶标仪：TECAN公司台式高速离心机：eppendorf公司其余同前两部分 1.2普通耗材

50mL/250mL细胞培养瓶：Nunc公司 6孔细胞培养板：Costar公司 60mm细胞培养皿：Costar公司细胞刮刀：Nunc公司 1.3主要试剂

Hoechst33258染色试剂盒：碧云天公司 PI和Annexin V-FITC：美国BD公司 TUNEL试剂盒：罗氏公司

鼠抗人Caspase-8 p10单抗：Cell Signaling HRP标记羊抗鼠二抗：武汉博士德公司

BCA法蛋白定量试剂盒：Pierce公司 ECL发光检测试剂盒：Pierce公司硝酸纤维素转移膜(0.22μm)Amersham公司 DAB北京中杉公司其余试剂同前两部分 1.4常用缓冲液及培养基结合缓冲液(×10)： 100 mmol/L HEPES(PH 7.5) 1.4 moL NaCl 25 mmol/L CaCl2 单去圬剂裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl(PH 8.0) 150 mmol/L NaCl 1%TritonX-100 100 g/mL PMSF

5×SDS蛋白上样缓冲液： 250 mmol/L Tris-HCl(PH 6.8) 10%SDS 50%甘油 0.5%溴酚蓝

500 mmol/L DTT(临用前现加) 电泳缓冲液：

25 mmol/L Tris-HCl(PH 7.4) 250 mmol/L甘氨酸(PH 8.3) 0.1%SDS 转移缓冲液：

5.6 mmol/L Tris-HCl(PH 7.4) 120 mmol/L甘氨酸 0.1%SDS 20%甲醇(V/V) 储存于4℃备用 PBS缓冲液 137 mmol/L NaCl 2.7 mmol/L KCl 10.0 mmol/L Na2HPO4 2.0 mmol/L KH2PO4 调节至PH=7.4

洗涤缓冲液(PBS-Tween-20)： 1000 mL PBS(PH7.4,0.01M) 500μL Tween-20 封闭缓冲液： 5 g脱脂奶粉 100 mL PBST 1.5细胞系

同第一部分 2方法

2.1 A549/DDP细胞凋亡的检测 2.1.1细胞凋亡形态学观察

将A549/DDP细胞分别加入到含盖玻片的6孔细胞培养板中，每孔细胞数为1×104个，培养过夜后，去培养液，加入含姜黄素终浓度为0、5、l0、20、30、40μmol/L的培养液继续培养24 h后终止培养，取出细胞爬片，按照Hoechst33258染色试剂盒说明书进行染色。 ①在细胞爬片上，轻轻滴加约500μL固定液，以刚覆盖爬片为宜，固定10分钟。

②去固定液，用PBS洗两遍，每次3分钟，吸尽液体，洗涤时用手晃动数次。

③加入0.5mLHoechst33258染色液，染色5分钟，用手晃动数次。 ④去染色液，用PBS洗两遍，每次3分钟，吸尽液体，洗涤时用手晃动数次。

⑤滴加一滴抗荧光淬灭封片剂于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，让细胞接触封片剂，避免气泡。

⑥上荧光显微镜观察，激发波长350nm，发射波长460nm。 2.1.2原位末端标记(TUNEL)染色

同上方法制备细胞爬片，PBS洗涤，4%多聚甲醛固定后，按照TUNEL 试剂盒说明书操作。

①在细胞爬片上，轻轻滴加约500μL固定液，以刚覆盖爬片为宜，

固定30分钟。

②PBS洗片两次，每次3分钟，吸尽液体，洗涤时用手晃动数次。滴加内源性过氧化物酶阻断剂(0.3%H2O2-甲醇溶液)，室温孵育30分钟。

③同上用PBS洗片，滴加通透液(0.1%TritonX-100溶于0.1%枸橼酸钠溶液中)，在冰浴中孵育2分钟。

④PBS洗两次，滴加50μL的TUNEL反应混合液，湿盒中室温孵育60分钟。

⑤PBS洗两次，滴加50μL的转化剂-POD，湿盒中37℃孵育30分钟。

⑥PBS洗两次，加入DAB底物溶液，室温孵育10分钟。 ⑦PBS洗两次，封片。光镜下观察。