响应面法优化玉木耳原生质体制备条件

南方农业学报JournalofSouthernAgriculture2020，51（1）：169-1751期2095-1191；ISSNCODENNNXAABhttp://www.nfnyxb.com·169·DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2020.01.022响应面法优化玉木耳原生质体制备条件

苏文英1，杨和川1，谭一罗1，周振玲1，秦裕营1，李

（1连云港市农业科学院，江苏连云港

晓2*

130118）

222006；2吉林农业大学食药用菌教育部工程中心，长春

摘要：【目的】优化玉木耳原生质体制备条件，获得高质量、高产量的原生质体，为后续玉木耳遗传育种、优良性状筛选和品种改良提供良好的试验材料。【方法】以玉木耳原生质体产量为考察指标，结合单因素试验和响应面优化法，建立原生质体制备回归方程，探究玉木耳原生质体的最佳制备条件。【结果】单因素试验结果表明，玉木耳原生质体制备的适宜条件为：酶解时间3h、酶解液浓度2.0%、酶解温度35℃。响应面试验结果表明，各因素对原生质体制备影响程度的排序为：酶解温度>酶解时间>酶解液浓度，酶解温度与酶解时间的交互作用对原生质体产量有极显著影响（P<0.01），酶解时间与酶解液浓度的交互作用影响显著（P<0.05）。响应面试验优化后，获得玉木耳原生质体的制备条件为：酶解液浓度2.0%、酶解时间3.4h、酶解温度35℃，此条件下玉木耳原生质体的平均产量为17.5×106CFU/mL，与理论产量（17.77×106CFU/mL）偏差小。【结论】利用响应面法可确立玉木耳原生质体制备的最佳条件，获得较理想的原生质体产量。

关键词：玉木耳；原生质体；响应面法；制备条件中图分类号：S646.6

文献标志码：A

文章编号：2095-1191（2020）01-0169-07

OptimizationofprotoplastformationofAuriculariacorneaby

responsesurfacemethodology

SUWen-ying1，YANGHe-chuan1，TANYi-luo1，ZHOUZhen-ling1，

QINYu-ying1，LIXiao2*

2

（1LianyungangAcademyofAgriculturalSciences，Lianyungang，Jiangsu222006，China；EngineeringResearchCenter

ofChineseMinistryofEducationforEdibleandMedicinalFungi，JilinAgriculturalUniversity，

Changchun130118，China）

Abstract：【Objective】TheobjectiveofthisstudywastooptimizethepreparationconditionsofprotoplastsofAuricu-lariacornea，andtoobtainhighqualityandhighyieldprotoplasts，whichprovidedgoodexperimentalmaterialsforthe

subsequentgeneticbreeding，excellenttraitscreeningandvarietyimprovementofA.cornea.【Method】TheprotoplastyieldofA.corneawasusedasanindex，andtheregressionequationofprotoplastpreparationwasestablishedbycombi-ningsinglefactorexperimentandresponsesurfaceoptimizationmethodtostudytheoptimalpreparationconditionsofpro-toplastsofA.cornea.【Result】Theresultsofsinglefactortestshowedthatthesuitableenzymatichydrolysistimeofproto-plastpreparationwas3h，theenzymatichydrolysisliquidconcentrationwas2.0%，andtheenzymatichydrolysistempera-turewas35℃.Theresultsofresponsesurfacemethodologyshowedthatthedegreeofinfluenceofvariousfactorsonpro-toplastpreparationwas：enzymatichydrolysistemperature>enzymatichydrolysistime>enzymatichydrolysisliquidcon-centration，andtheinteractionbetweenenzymatichydrolysistemperatureandenzymatichydrolysistimehadahighlysig-nificanteffectonprotoplastyield（P<0.01），andtheinteractionbetweenenzymatichydrolysistimeandenzymatichydroly-sisliquidconcentrationhadsignificantinfluence（P<0.05）.Theresultsoftheresponsesurfacetestwereasfollows:enzy-matichydrolysisliquidconcentration2.0%，enzymatichydrolysistime3.4h，enzymatichydrolysistemperature35℃.Undertheseconditions，theaverageyieldofprotoplastsofA.cornea.was17.5×106CFU/mL，whichwaslowerthanthetheoreticalyield（17.77×106CFU/mL）.【Conclusion】Theresponsesurfacemethodisusedtoestablishtheoptimalcondi-tionsforthepreparationofprotoplastsofA.cornea，andtheoptimalprotoplastyieldisobtained.

Keywords：Auriculariacornea；protoplast；responsesurfacemethod；preparationconditionsFoundationitem：JilinNaturalScienceFoundation（20170101053JC）；LianyungangSpecialFinancialProject（QN-JJ1808）

收稿日期：2019-03-05

基金项目：吉林省自然科学基金项目（20170101053JC）；连云港市财政专项（QNJJ1808）作者简介：*为通讯作者，李晓（1976-），副教授，主要从事食用菌教学及产业化开发研究工作，E-mail：lxmogu@163.com。苏文英

（1992-），主要从事食用菌分子生物学研究工作，E-mail：18004425758@163.com

·170·南方农业学报51卷0引言

【研究意义】玉木耳（AuriculariacorneaEhrenb.）隶属于木耳科（Auriculariales）木耳属（Auricularia），是毛木耳的白色变种（李晓和张阔谭，2016），为吉林农业大学食药用菌教育部工程中心选育出的适合吊袋小孔出耳的木耳新品种，其质地脆嫩，美味可口，营养丰富（李玉和李晓，2016），且具有抗肿瘤等功效（曹玉春等，2017），经济价值较高，极具开发潜质。目前关于玉木耳的研究主要集中在栽培、生理活性及成分分析方面（李晓和苏文英，2017；Wangetal.，2018），针对其分子遗传学的研究还鲜有报道。原生质体是生理学、细胞学研究与遗传育种的重要材料（谭伟等，2001；李守勉等，2007）。因此，对玉木耳原生质体制备进行系统研究，可为后续玉木耳遗传育种、优良性状筛选和品种改良提供良好的试验材料。【前人研究进展】关于食用菌原生质体的制备已有广泛研究，许修宏等（2011）通过单因素试验获得黑木耳原生质体制备的最佳条件：黑木耳菌丝液体培养8d，以0.6mol/LMgSO4·7H2O作渗透压稳定剂，加入2.0%溶壁酶在31℃下酶解4h。孙露等（2012）对毛木耳原生质体制备条件进行优化，获得最佳制备条件：菌龄5d，溶壁酶浓度1.5%，酶解温度30℃，酶解时间3h，渗透压稳定剂为0.5mol/L甘露醇。马跃腾等（2015）采用正交试验对秦巴蛹虫草原生质体制备条件进行优化，在最佳制备条件［以0.6mol/LNa-Cl为稳渗剂，用混合酶（1%纤维素酶和0.5%蜗牛酶按1∶1的体积比混合）在（26±1）℃下对菌龄6d的菌丝酶解3h］下获得的原生质体产量最高。陆欢等（2018）通过响应面法对花脸香蘑原生质体制备条件进行优化，获得最佳制备条件：以0.6mol/mL甘露醇作稳渗剂，1%溶菌酶+1%蜗牛酶+1%纤维素酶为复合酶解液，酶解温度30℃，60~70r/min摇床振荡培养，酶解4h。崔玮洁等（2019）对玉木耳原生质体的制备进行研究，通过单因素试验得出以培养15d的玉木耳菌丝为原材料，0.6mol/L甘露醇作稳渗剂，2%溶壁酶作酶解液，27℃酶解5h时，可获得最大量的玉木耳原生质体。【本研究切入点】原生质体制备受菌龄、稳渗剂浓度、酶解液浓度、酶解时间及酶解温度等因素的交互影响，响应面优化法能对多个因素的组合效应进行研究，从而获得最优试验条件（Ragoneseetal.，2002）。目前关于玉木耳原生质体制备的报道很少，尚不清楚其原生质体制备影响因子间的相互作用效应。【拟解决的关键问题】在单因素试验的基础上，结合响应面法进一步对玉木耳原

生质体制备条件进行优化，以期获得高质量、高产量

的原生质体，为后续玉木耳遗传育种、优良性状筛选和品种改良提供良好的试验材料。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试菌株和试剂玉木耳菌株（菌种编号CCMJ2567）由吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心提供。溶壁酶购自广东省微生物菌种保藏中心，其余药品均为国产分析纯。

1.1.2主要溶液及培养基稳渗剂（0.6mol/L）：称取甘露醇10.93g，用蒸馏水定容至100mL，121℃高压灭菌20min。酶解液：于10mL稳渗剂0.6mol/L）中加入0.2g溶壁酶，经0.2μm细菌过滤膜过滤除菌，现配现用。玉木耳液体MYG培养基：麦芽糖10g，葡萄糖5g，酵母浸粉5g，蒸馏水定容至1000mL，121℃高压灭菌20min。原生质体固体MYG再生培养基：麦芽糖10g，葡萄糖5g，酵母浸粉5g，琼脂10g，甘露醇109.3g，蒸馏水定容至1000mL，121℃高压灭菌20min。

1.1.3主要仪器设备净化工作台（SW-CJ-2FD，苏州净化设备有限公司）、生物显微镜（XSP-BM-8C，上海彼爱姆光学仪器制造有限公司）、高速冷冻离心机［5804R，艾本德（德国）］、恒温摇床（HZQ-2，金坛市城东超韵实验仪器厂）、恒温金属浴（HX-20L，上海沪析实业有限公司）和灭菌锅（YM75Z，上海三申医疗器械有限公司）。1.2试验方法

1.2.1原生质体制备将玉木耳菌丝块接种至液体MYG培养基中，25℃静置培养13d，去除液体培养基，将收集得到的玉木耳菌丝用无菌蒸馏水清洗2次，0.6mol/L稳渗剂洗涤2次，再用已灭菌的滤纸吸取多余水分。称取处理后的菌丝200~300mg置于1.5mL离心管中，加入3倍菌丝体积的酶解液，于30℃恒温金属浴中酶解3h，得到玉木耳原生质体粗提液。在超净工作台中，将原生质体粗提液用已灭菌的脱脂棉过滤，滤液在室温、3000r/min下离心5min，去除上清液，再用0.6mol/L稳渗剂洗涤2次，得到纯化的原生质体，将其立即悬浮于0.6mol/L稳渗剂中，显微镜下用血球计数板计数，即为原生质体产量。

1.2.2玉木耳原生质体再生将新鲜制备的原生质体悬液用0.6mol/L稳渗剂稀释至1×104CFU/mL，取100μL涂布于固体MYG再生培养基上；同时用灭菌蒸馏水将原生质体悬液稀释至同等浓度，取

（1期苏文英等：响应面法优化玉木耳原生质体制备条件

·171·100μL涂布于固体MYG再生培养基上作为对照，将

试验组与对照组同时置于25℃恒温培养箱培养10d后计算原生质体再生率（韩业君等，2004）。再生率（%）=（再生菌落数-对照组菌落数）/原生质体总数×100。

1.2.3单因素试验设计分别考察酶解时间（1、2、3、4和5h）、酶解液浓度（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%）和酶解温度（20、25、30、35和40℃）3个因素对玉木耳原生质体制备的影响，每个试验3次重复。1.2.4响应面试验设计在单因素试验基础上，依据Box-BehnkenDesign设计原理，选取酶解时间A）、酶解液浓度（B）和酶解温度（C）为考察因素，以原生质体产量（Y）为响应值，进行3因素3水平的响应面试验设计，以确定玉木耳原生质体的最佳制备条件。因素及水平见表1。

表1响应面试验设计因素与水平

Table1Factorsandlevelsofresponsesurfacetestdesign

因素编码水平LevelFactor

Code-101

酶解时间（h）EnzymolysisdurationA234酶解液浓度（%）EnzymolysisliquidconcentrationB1.52.02.5酶解温度（℃）EnzymolysistemperatureC253035

1.3

统计分析

采用Excel2016对试验数据进行统计分析，利用SPSS17.0进行显著性差异分析，Design-Expert8.0.6对响应面试验设计方案及结果进行分析。

2结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1酶解时间对玉木耳原生质体制备的影响不同食用菌的细胞壁厚薄不同，所以酶解时间也不相同。由图1可知，在酶解温度30℃、酶解液浓度2.0%的条件下，随着酶解时间的延长，玉木耳原生质体产量和再生率不断增加，当酶解时间为3h时，原生质体产量和再生率最高，分别为13.5×106CFU/mL和6.71%，均显著高于其他酶解时间的原生质体产量和再生率（P<0.05，下同）；但酶解时间超过3h后，原生质体产量和再生率反而不断降低。因此，选择2~4h为适宜酶解时间。

2.1.2不同酶解液浓度对玉木耳原生质体制备的影响由图2可知，在酶解温度30℃、酶解时间3h的条件下，随着酶解液浓度的增加，玉木耳原生质体产量和再生率不断显著增加，当酶解液浓度增至2.0%时，原生质体产量和再生率均达最高值，分别为18.5×106CFU/mL和9.17%；酶解液浓度大于2.0%后，原生质体产量和再生率有所下降，但酶解液浓度

原生质体产量Protoplastyield

L）m１再生率Regeneration１６４．．００ａａrate８etar/U７．nFoiCdtle１１２０．０ｂｃｂ６．０００ar60iye1n×ts５．０eag量（lep８．４．００００R产oto体r６．０ｄｄｃｃｂ４．００３．００%）P质２．０２．００率（生生原０．．００１．００再１２３４５０．．００００酶解时间（h）Enzymolysisduration图1酶解时间对玉木耳原生质体制备及再生的影响

Fig.1Effectsofdifferentenzymolysistimesonthepreparation

andregenerationofA.corneaprotoplasts

同一测定指标图柱上的不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。图2和图3同

Differentlowercaselettersonthebarforthesameindexindicatedsig-nificantdifference（P<0.05）.ThesamewasappliedinFig.2andFig.3

原生质体产量Protoplastyield

２５．０再生率RegenerationrateL）mａ/UFCdl２ａｂ１０．００et８．００arnoita6r0ye1n×tsa１０５．ei．００ｄｂｃａ量（lp产otｃ６．００egeRo１０体rP质生５．．００ｄｅ２４．．００００%）率（原０．００．００生再0.5１1.0２1.5３2.0４2.5５酶解液浓度（%）Enzymolysisliquidconcentration图2酶解液浓度对玉木耳原生质体制备及再生的影响

Fig.2Effectsofenzymolysisliquidconcentrationonthepre-parationandregenerationofA.corneaprotoplasts

2.5%与2.0%的原生质体产量间无显著差异（P>0.05）。因此，选择1.5%~2.5%为适宜酶解液浓度。

2.1.3不同酶解温度对玉木耳原生质体制备的影响由图3可知，在酶解液浓度2.0%、酶解时间3h的条件下，随着酶解温度的升高，玉木耳原生质体产量和再生率也随之升高，当酶解温度达35℃时，原生质体产量和再生率最高，分别为18.0×106CFU/mL和8.90%；但酶解温度高于35℃时，原生质体产量和再生率反而快速降低。因此，选择25~35℃为适宜酶解温度。

2.2玉木耳原生质体制备条件优化结果

2.2.1Box-Behnken设计试验结果根据单因素试验结果，采用Design-Expert8.0.6设计试验方案，共设计17个试验组，试验结果见表2。对Box-Behnken试验结果进行回归方差分析（表3），得到回归方程：Y=-211.85375+63.56500A+85.25250B+2.79725C-2.00000AB-0.52500AC+0.055000BC-

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