文章编号: 1000-1336(201102-0285-07 陈 皓 夏海滨
陕西师范大学生命科学学院基因治疗研究室，西安 710062
摘要：四环素(Tet诱导调控表达系统是在大肠杆菌Tn10转座子中特异的Tet 抗性操纵子基础上建立起来的一种用于诱导基因表达的调控系统。经过近几年来的发展，衍生出了Tet-on 、Tet-off 两套调控系统；随着对Tet 诱导调控表达系统的改进，其对基因表达调控的严谨性、诱导效率及安全性等方面逐步得到改善，并被广泛应用于基础研究及体内外的实验治疗研究。此外Tet 诱导调控系统与其他诱导调控体系及新兴技术的联合应用，为疾病的基因治疗研究提供有力的手段。关键词：四环素；基因治疗；诱导调控中图分类号：Q78
基因的调控表达可以使基因功能的研究变得更为细致。此外，在基因治疗过程中任何外源基因的过度或不适当的表达都会影响到基因治疗的效果。因此实施对基因表达的调控无论是在基因功能研究方面还是在疾病的基因治疗研究中都具有十分重要的意义及实际应用价值。1992年Gossen 等[1]成功地利用原核基因调控元件构建了四环素(tetracycline, Tet真核细胞基因调控表达系统，它利用Tet 及其衍生物对所感兴趣的基因进行诱导表达。随着人们对该系统的不断改进，使这种诱导表达具有严密、高效、可控性强、表达泄露小等优点。目前真核细胞基因诱导表达系统已被广泛应用于基因功能研究及基因治疗研究，为疾病的基因治疗提供了安全的体系。本文将从Tet 诱导调控基因表达系统的作用原理、系统改进及其应用等方面的研究作一综述，从而为人们选择合适的诱导表达系统用于自己的研究提供有用的信息。
Tet 诱导调控表达系统的基本原理是由诱导药物如Tet 改变调控蛋白质的构象，从而控制目标蛋白质的表达[1(A]。最初的Tet 诱导调控基因表达系统是
收稿日期：2010-10-08
国家自然科学基金项目(30872993资助
作者简介：陈皓(1982-，男，硕士生，E-mail ：chandcn_0904 @126.com；夏海滨(1965-，男，博士，教授，通讯作者，E-mail ：hbxia2001@163.com
以大肠杆菌Tn10转座子上Tet 抗性操纵子为基础而建立的。Tet 阻遏蛋白(Tet repressor protein, TetR与Tet 操纵基因(Tet operator, TetODNA序列有特异的亲和能力，当细胞内无Tet 存在时，TetR 会与TetO 结合，从而阻断下游的抗性基因表达。当有Tet 存在时，药物使TetR 的构象发生改变，导致TetR 与TetO 分离，从而引起抗性基因的抑制解除，抗性蛋白表达使细菌产生耐药性。利用TetR 和TetO 特异结合的特性，研究人员发展了多种类型的Tet 调控系统，但根据其表达特点可以归为两大类：抑制型系统Tet-off 和激活性系统Tet-on 。1.1 Tet-off系统
Gossen 等[1]最早建立了Tet-off 基因调控表达系统，该系统由调节表达载体和反应表达载体组成。调节表达载体包含一个由人巨细胞病毒早期启动子(PhCMV 启动的Tet 转录活化因子(tetracycline transcrip-tional activator, tTA ，tTA 由TetR 与单纯疱疹病毒(HSVVP16蛋白质C 端的一段转录激活区融合而成。反应表达载体由Tet 应答元件(Tet-responsive element, TRE 、最小CMV 启动子(minimal CMV promoter, P minCMV 及目的基因组成。目的基因位于TRE 和P minCMV 的下游；TRE 为7次重复的TetO 序列。P minCMV 缺失增强子，因此在tTA 未结合到TRE 时，目的基因不表达；相反，当tTA 结合到TRE 时，VP16会使P minCMV 活化从而使基因表达。当细胞内无Tet 或其衍生物强力霉素(doxcycline, Dox的存在时，tTA 可与TRE 结合，
1 Tet 诱导调控系统的结构和原理[39]
(ATet系统的基本结构示意图。Tet 系统由调控蛋白(tTA, rtTA, tTS, rtTS的表达框和目的基因表达框组成。调控蛋白由一个强启动子驱动；而在目的基因的表达框中，启动子位于Tet 应答元件(Tet-responsive element, TRE的下游，调控蛋白可以通过TRE 对下游启动子进行调控。(BTet-off示意图。tTA 是由TetR 和病毒转录激活域VP16融合而成的蛋白。当不存在Dox 时，tTA 和TRE 结合，启动P minCMV 的下游基因表达；当存在Dox 时，Dox 使tTA 的构象发生改变，tTA 会从TRE 上脱落，从而导致TRE-P minCMV 下游基因表达关闭。(CTet-on示意图。rtTA 是由rTetR 和VP16融合而成的蛋白，它的表型与tTA 相反。当Dox 不存在时，rtTA 不能结合TRE ，TRE-P minCMV 下游基因表达关闭；当存在Dox 时，rtTA 构象改变，rtTA 结合TRE ，则TRE-P minCMV 下游基因表达开启。(DK
RAB Tet-on示意图。tTS 是由TetR 与强转录抑制因子K ox1蛋白N 端具有转录抑制作用的K RAB-AB 区域融合而成的。当Dox 不存在时，tTS 结合TRE ，下游基因的表达被抑制；当Dox 存在时，tTS 不结合TRE ，则下游基因表达开启。(EK RAB Tet-off示意图。rtTS 是和tTS 相反表型的调控蛋白。当Dox 不存在时，rtTS 不结合TRE ，下游基因的表达开启；当Dox 存在时，rtTS 结合TRE ，则下游基因表达被抑制。(F复合Tet-off 系统示意图。复合的Tet-Off 系统同时存在tTA 和rtTS 两种调控蛋白。当Dox 不存在时，rtTS 不结合TRE ，不对启动子进行抑制，同时tTA 结合TRE 激活启动子，基因表达开启；当Dox 存在时，tTA 从TRE 上脱落，启动子不被激活，同时rtTS 结合TRE ，抑制下游基因表达。(G复合Tet-On 系统示意图。该系统同时存在rtTA 和tTS 两种调控蛋白。当Dox 不存在时，rtTA 不结合TRE ，不激活启动子，同时tTS 结合TRE ，抑制启动子，基因表达关闭；当Dox 存在时，tTS 从TRE 脱落，基因抑制解除，同时rtTA 结合TRE ，启动子被激活。(H自身循环调控的Tet-On 系统示意图。该系统是将调控蛋白rtTA 放在其自身启动子之后并通过内部核糖体进入位点(internal ribosomal entry site, IRES连接目的基因，使调控蛋白和目的基因受控于同一个启动子。当Dox 不存在时，rtTA 几乎不表达，且不与TRE 结合，启动子无法激活，基因表达关闭；当Dox 存在时，微量表达的rtTA 逐渐激活启动子，使自身的表达量也升高，实现逐级放大的效果，从而导致目的基因的开启。
打开基因表达；而当Tet 或Dox 存在时，它们可使tTA 中的TetR 改变构象，则tTA 将从TRE 上脱落下来，使TRE 中的P minCMV 处于非激活状态，从而使基因表达处于关闭状态[1(B]。1.2 Tet-on调控系统
Tet-on 调控系统与Tet-off 调控系统的区别在于其调节蛋白质为反义Tet 转录活化因子(reverse tetracy-cline transcriptional activator, rtTA。rtTA 是由反义TetR(reverse TetR, rTetR与VP16的转录活化区域融合而成。rTetR 由TetR 中的4个氨基酸发生突变而衍生而来的[2](E 71→K 71, D 95→N 95, L 101→S 101, G102→D102。rTetR 的表型与TetR 相反，在无Dox 时其不能结合TRE ，导致基因表达关闭；而在有Dox 存在时其会结合在T R E 上，导致基因表达开放[1(C]。
Tet 系统具有低本底与高诱导倍数的特点。无诱导时目的基因表达水平低，诱导时其表达水平增高，最高诱导倍数可达10,000倍。目的基因的诱导倍数与诱导剂的量及诱导时间存在一定的关系，所以人们可以采用Tet 诱导调控表达系统对基因表达进行精确的调节。原核来源的TetR 与TetO 的结合特异性高，哺乳动物细胞中无类似的DNA 靶序列，因此该
系统调控特异性高，宿主基因不受影响，适合于体内外的各种基因表达的调控。Tet 系统的诱导药物为Tet 或其衍生物(如Dox 。Tet 作为一种抗生素已被人们应用了很长时间，是对人体较为安全的一种药物。并且在Tet 系统中低剂量的Tet 就可调节基因的表达，所以不会对动物或细胞产生强毒性。该系统诱导所需的时间短，在加入诱导剂30分钟内即可检测到目的基因的表达；当去除诱导剂一定时间后可使该系统关闭，之后仍可通过加入诱导剂重新开启，因此该诱导系统是一种可逆系统。诱导药物如Dox 等可穿越胎盘屏障，也存在乳汁中，故该系统适用于转基因研究。
Tet 诱导调控表达系统尽管得到了广泛的应用，但是依然存在不足，为此人们对该系统做出了一些改进。
3.1 tTA/rtTA的改造
通过体内研究发现，要完全激活Tet-On 系统中的P minCMV 启动子需要小鼠体内Dox 的浓度达到1-2
[3]
μg/ml，而血脑屏障的阻碍作用使得脑组织中的Dox
很难以达到该作用浓度[4]，因此限制了Tet-on 系统在脑组织中的作用。同时当在Dox 不存时，rtTA 与TetO 仍可以结合，造成了该系统具有一定的背景表达。
四环素诱导调控表达系统的研究与应用(精)
