呼吸内科多重耐药铜绿假单胞菌相关耐药基因检测分析＊
蓝 锴，程招敏，唐小龙，周 强，张 文，庞雪云
【摘 要】摘 要:目的 了解该院呼吸内科分离多重耐药铜绿假单胞菌氨基糖苷类修饰酶基因和β－内酰胺酶基因携带情况。方法 用聚合酶链反应技术检测14株多重耐药铜绿假单胞菌耐药相关基因。结果 除GIM、SPM、VIM－1、VIM－2、CTX－M、aac（3′）－Ⅰ、aac（3′）－Ⅱ、ant（3″）－Ⅰ基因全部为阴性外，其余耐药基因有不同程度的阳性。结论 携带多种耐药基因是呼吸内科多重耐药铜绿假单胞菌对氨基糖苷类和β－内酰胺类抗菌剂耐药的重要机制。 【期刊名称】国际检验医学杂志 【年(卷),期】2012(033)014 【总页数】3
【关键词】关键词:假单胞菌，铜绿；多重耐药；耐药基因
铜绿假单胞菌（Pae）是重要的医院感染致病菌，多见于原有心肺疾病，长期使用抗菌剂、激素、抗癌药物以及免疫功能低下，或应用呼吸机、雾化器治疗的病患，因此，Pae已成为呼吸科最常见的医院感染致病菌。由Pae引起的肺部感染起病可急可慢，部分呈隐匿发病。重者有寒战、高热等症状，咳大量黄色脓稠痰，典型者咳翠绿色脓性痰；有气短、进行性紫绀，严重者可出现呼吸衰竭，周围循环衰竭，因此，及时的抗感染治疗对于拯救病患非常重要。而Pae在抗菌剂选择压力下几天就能产生耐药性，尤其随着免疫抑制剂、激素和介入治疗等广泛应用，多重耐药、泛耐药Pae株屡见不鲜，给临床抗感染治疗带来极大的困扰。Pae耐药机制极为复杂，获得多种β－内酰胺酶和氨基糖苷修饰酶，导致对β－内酰胺类抗菌剂和氨基糖苷类抗菌剂耐药［1－3]。因此，
作者收集了本院呼吸内科分离的多重耐药Pae菌，研究常见β－内酰胺酶和氨基糖苷类修饰酶相关基因携带情况，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 菌株 2011年本院呼吸科患者分离到多重耐药Pae共计14株（3种不同类型抗菌剂耐药），同一患者不同时期和不同标本类型不重复计入。患者标本类型包括深部痰、中段尿、血、伤口拭子、脓液、胸水等。质控菌株用大肠埃希菌（ATCC25922）、铜绿假单胞菌（ATCC27853）。 1.2 仪器与试剂
1.2.1 仪器 西门子MicroScan WalkAway 96plus全自动细菌鉴定及药敏分析仪；BIO－RAD电泳仪；BIO－RAD Hood 2成像仪；高速冰冻离心机；GeneAmp PCR System 9700PCR仪。
1.2.2 试剂 MicroScan WalkAway 96plus配套革兰阴性杆菌复合鉴定药敏板（NC31），检测并报告14种抗菌剂：阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、哌拉西林、哌拉西林／他唑巴坦、替卡西林／棒酸、头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南、环丙沙星、左氧氟沙星。K－B法检测抗菌剂：美罗培南。所有药敏纸片均购自Oxoid公司；哥伦比亚血平板、MH琼脂平板均为江门凯林生物有限公司产品。引物由Invitrogen生物工程公司合成；Tap酶、dNTP、MgCl2、buffer购自Takara公司；琼脂糖购自Sigma，DNA marker购自BBI公司。 1.3 方法
1.3.1 菌株鉴定及药敏实验 所有临床分离菌株均用 MicroScan WalkAway 96plus及其配套NC31卡进行鉴定及药敏分析，因该检测卡无美罗培南检测结
果，因此美罗培南用K－B法进行检测报告。实验方法与判断标准参照CLSI 2009年版［4]。
1.3.2 耐药基因检测 采用煮沸法 提取细 菌 DNA［5]，于－20℃保存备用。采用聚合酶链反应（PCR）扩增耐药基因。引物序列和目的产物长度见表1。扩增体系为：P1、P2引物各0.5μmol／L，MgCl22mmol／L，KCl 10mmol／L，（NH4）2SO48 mmol／L，Tris－HCl（pH9.0）10mmol／L，NP400.5%，BSA 0.02%（w／v），Taq DNAase 1U，计15μL，另加入模版DNA 5μL。PCR循环参数为：92℃预变性5min；92℃×40s，55℃×40s，72℃×60s，循环30次后72℃延伸10min。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察分析，记录结果。
2 结 果
2.1 14株多重耐药菌药敏情况 本院呼吸内科分离多重耐药Pae对第三代头孢药物耐药性较高，碳青霉烯类抗菌剂总体耐药率达50%，见表2。
2.2 PCR检测耐药基因结果 14株多重耐药Pae菌株β－内酰胺酶基因以携带TEM（10／14，71.4%）基因为主，氨基糖苷类修饰酶基因以aac（6′）－Ⅰb（8／14，57.1%）和ant2′－1（7／14，50%）为主。14株多重耐药株中有6株耐碳青霉烯类，其耐药基因以IMP－1基因（5／6，83.3%）多见，而 OprD2缺失仅2株，与广州其他地区多重耐药Pae相关耐药基因携带情况差别较大［1]。具体基因携带情况见表3。
3 讨 论
鉴于铜绿假单胞菌在抗菌剂选择压力下容易出现耐药且耐药机制的复杂性，β－内酰胺类和氨基糖苷类抗菌剂联合用药往往是呼吸内科治疗Pae感染常用手段，
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