2016江南大学微生物研究生复试内容

由天下分享时间：2024/9/13 18:50:01 加入收藏我要投稿点赞

好难

2005微生物实验操作复试

1有哪些方法可以提高显微镜的分辨率？

答：显微镜的分辨率（

Resolving power）是指显微镜将样品上相互接近的两点清晰分辨出来的能力。其用镜

头所能分辨出的两点间的最小距离表示，距离越小，分辨能力越好。可用公式表示：

物镜的数值口径（

12N.A

Numberical aperture），简写为（N.A）：表示从聚光镜发出的锥形光柱照射在观察标本上，

能被物镜所聚集的量。可用公式表示：

N.A

n——标本和物镜之间介质的折射率

θ——由光源投射到透镜上的光线和光轴之间的最大夹角可见物镜的分辨率是由物镜的

nsin

NA值与照明光源的波长两个因素决定。

D值，可采取以下措施（2）增大介质

NA值越大，照明光线波长越短，则D

值越小，分辨率就越高。要提高分辨率，即减小

（1）降低波长λ值，使用短波长光源。θ值以提高NA值。（4）增加明暗反差。2革兰氏染色的步骤？哪几步最为关键？

n值以提高NA值（NA=nsinu/2）。（3）增大孔径角

答：（1）1、细菌的活化：将细菌接种营养琼脂斜面，培养

2、制片：取菌种培养物常规涂片、干燥、固定。3、初染：于制片上滴加结晶紫染液，染色4、媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约

16-24h。

1min后，用水洗去剩余染料。1min，水洗。

95%乙醇从载玻片上端冲洗脱色，

5、脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，直接用

直到流下的酒精无明显紫色时，立即水洗。

6、复染：滴加番红液，染色7、用滤纸吸干，油镜镜检。

2min，水洗

（2）脱色是革兰氏染色中最为关键的步骤，其中乙醇的浓度，用量及涂片厚度都会影响脱色速度，最终影响观察效果。如果脱色过度，有可能会使革兰氏阳性菌呈假阴性；如果脱色不够，有可能使革兰氏阴性菌呈假阳性

3涂片染色前为什么要先进行固定？固定时应注意什么问题？答：1）杀死微生物，固定细胞结构。

2）保证菌体能更牢的粘附在载玻片上，防止标本被水冲洗掉。3）改变染料对细胞的通透性，因为死的原生质比活的原生质易于染色。

注意问题：温度以载玻片接触手背，手背不觉得烫为宜，防止出现变形细胞；注意在通过火焰时，涂有细菌的一面向上。

4同一酵母菌培养液用血球计数板和平板菌落计数法同时计数，所得结果是否一样？为什么？进一步比较两种计数法的优缺点？

答：所得结果不一样。血球计数板记得的菌体数是活菌体和死菌体的总和，而平板菌落计数法记得的是活菌体的量。

血球计数板优点是直观、快速，方便，但该法计数的是样品中的总菌落数，无法计数活菌数。平板菌落计数法的优点是能粗出样品中的活菌数，缺点是手续较繁，而且测定值常受各种因素的影响。5如何测定水中的大肠菌群数？测定水肠菌群数有什么实际意义？

答：大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。

检测大肠菌群的

方法有稀释培养法和膜滤法两种，其中稀释培养法是标准分析方法，包括处发酵试验、平板分离和复发酵试验三部分。具体方法为①采样、②处发酵试验③在指示性培养基上分离培养，④革兰氏染色及镜检，⑤复发酵试验，⑥结果。

检测意义：水中的病原菌多数来源于病人和病畜的粪便，由于病原菌的数量少，检测过程复杂，因此，直接

测它们的存在非常困难。由于大肠杆菌在粪便中数量大，在体外存活时间与肠道致病菌相近，而且检测方法比较简便，因此采用测定大肠菌群或大肠杆菌的数量来作为水被粪便污染的标志。如果水肠菌群菌数超过一定数量，则说明此水已被粪便污染，肯能还有病原菌。6高压蒸汽灭菌的基本原理以及步骤

答：高压蒸汽灭菌是将物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅，在一定压力下保持

15-30分钟进行灭菌。将待灭菌的物

品放在一个密闭的加压锅，通过加热，是灭菌锅夹套间的水沸腾而产生蒸汽，待水蒸气急剧的将锅冷空气从排气阀中排尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅压力，从而使沸点增高，获得高于100°C的温度，导致菌体蛋白凝固变性而达到灭菌的目的。具体步骤：①.加水②装料③加盖④排气⑤升压⑥保压⑦降压⑧无菌检查7如何制备大肠杆菌感受态细胞？

答：感受态细胞就是细菌最容易实现转化的状态。感受态细胞可以通过理化因素诱导产生，其中制备大肠杆菌感受态最常用的方法是

CaCl2法。将细胞置于

0℃的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞会膨胀成球形，细胞膜的通透性

会发生改变。此外还可以应用

PEG法和电击法，其中电击法可以实现大肠杆菌较高效率的转化。

LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

OD值为0.3-0.4，于冰水中迅速冷却。

15min，于4℃，4000r/min离心5min，弃去上清液，加入预冷MgCl2-CaCl2

CaCl2溶液2ml悬浮菌体。于冰水中放置

15min，

步骤：1、挑取大肠杆菌新鲜菌落于

3、菌液置预冷的离心管中冰浴

溶液20ml，于冰水中放置分装至离心管中，每管

15min。

2、取0.2ml培养液于含50mlLB培养液的三角瓶中，37℃震荡培养至

4、于4℃，4000r/min离心5min，弃去上清液，用预冷

200ul。

8简述移液管和培养皿的包扎注意事项答：1、培养皿：包扎前洗净烘干，包扎时每

10套迭在一起，用牛皮纸包扎后再用绳子捆扎，防止分散开。

45°卷起，并包扎好，以防散开。

2、移液管：包扎前洗净烘干，在孔吸的一端塞入少许脱脂棉，防止菌体误吸入口中及口中的微生物吸入管而进入培养物造成污染，塞入棉花量要适宜，不宜露在管口外面；包扎时，卷纸成9 NTG诱变的机理以及诱变的步骤。简述每一步操作的理由

答：NTG为烷化剂的一种，其存在多个活性烷基，可以烷化磷酸基、嘌呤、嘧啶等而与DNA发生作用。

其中鸟嘌呤N7是最容易起反应的位点。烷化后的鸟嘌呤易于离子化，由原来的酮式变为不稳定的烯醇式，从而与胸腺嘧啶配对而不与胞嘧啶配对，造成GC-AT转换。此外，NTG还可以引起染色体小围切除、移码突变及GC对的缺失等突变。另外据认为NTG的作用是伴随着重氮甲烷的生成及在酸性条件下生成亚硝酸，直接作用于细胞的DNA复制系统，从而诱发了变异。步骤（以黑曲霉为例）：1、单孢子悬液制备：取斜面，加入6ml，0.1mol/L，pH6.0的磷酸缓冲液，用接种环刮下孢子，振荡试管并过滤，制得单孢子悬液，使孢子良好分散，为诱变做准备。

2、NTG溶液制备：精确称取2mgNTG，加入2ml，0.1mol/L，pH6.0的磷酸缓冲液，,与暗处震荡溶解，防止NTG分解。

3、诱变处理：吸取NTG液1ml，加入到1ml孢子悬液中，30℃震荡30min，稀释1000倍停止作用，然后以10-2和10-4两个稀释度分离培养，30℃，3d后计数。4、死亡率计算：将未处理的孢子液根据前后处理活孢子数计算死亡率。5：筛选目标菌株。

10微生物紫外线诱变后应如何培养？为什么？

1ml加入1ml磷酸缓冲液中，同上逐级稀释分离，30℃培养3d，

答：UV诱变后应在红光下进行后续操作，并放置在黑暗条件下培养。

原因：微生物经UV诱变后，如果立即暴露在可见光下，出现明显降低死亡率的现象即光复活作用。微生物经紫外照射后，DNA分子中会产生嘧啶二聚体，造成局部DNA分子无法配对，引起微生物死亡或突变。为这种二聚体会在黑暗下被光解酶结合，这种复合物在可见光下被激活，使二聚体重新分解成单体，从而降低了微生物的死亡率或突变率。

2006微生物实验操作复试

5如何测量酿酒酵母的大小？

答：酿酒酵母个体较小，需要在显微镜下借助于特殊的测量工具——测微尺来测定其大小。测微尺包括镜台测微尺和接目测微尺。镜台测微尺是一中央部分刻有精确等分线的载玻片，专门用于校定接目镜测微尺每小格的相对长度。接目测微尺是一块可以放入接目镜的圆形小玻片，小格的两种。

由于接目测微尺所测量的是经显微镜放大后的细胞物象，因此，在不同的显微镜或不同的目镜和物镜组合放大倍数不同，接目镜测微尺每一小格所代表的实际长度也不一样。所以，在用接目测微尺测量微生物大小之前，必须先用镜台测微尺校定接目镜测微尺，以确定该显微镜在特定放大倍数的目镜和物镜下，接目镜测微尺每一小格所代表的实际长度，然后根据微生物细胞相当于的接目镜测微尺格数，计算出微生物细胞的实际大小。操作步骤1.2.

装接目测微尺：取下显微镜的目镜，将接目镜测微尺刻度朝接目测微尺的标定：1)2)

放镜台测微尺：将镜台测微尺刻度面朝

上固定在显微镜的载物台上，注意不可放反。

标定：将低倍镜转入光路，镜台测微尺有刻度的部分移至视野中央，调节焦距，当清晰地看到镜台测微尺的刻度后，转动目镜使接目测微尺与镜台测微尺的刻度相平行。利用移动钮移动镜台测微尺，使两尺在某一区域两线完全重合，然后分别数出两重合线之间镜台测微尺和接目测微尺所占的格数。测微尺的一条刻度线与镜台测微尺的一条刻度线相重合，再寻另一重合线，分别数出其间镜台测微尺和接目测微尺所占的格数）3)4)

用同样的方法，在高倍镜下对接目测微尺进行标定。计算：已知镜台测微尺每格长格所代表的长度。

接目测微尺每格长度（

μｍ）=10n/m

n：两重合线间镜台测微尺格数m：两重合线间接目测微尺格数

微生物细胞大小的测量

接目测微尺标定完毕后，取下镜台测微尺，换上微生物标本片，将其固定在载物台上，先用低倍镜找到标本片图象，然后根据不同的微生物对象分别转换到高倍镜下，用接目测微尺测量微生物细胞的直径或宽和长所占的格数，再依据所标定的高倍镜每一格的实际长度计算细胞的实际大小。

通常测定对数生长期菌体来代表该菌的大小，为了尽量减小实验误差，应在同一标本片上测量细胞，取其平均值作为该菌的大小。

维护：测量完毕，换上原有显微镜目镜（或取出接目测微尺，目镜放回镜筒）干净后放回盒保存，并按照显微镜的使用和维护方法擦拭物镜。6有哪些生理生化反应能够用于鉴别大肠杆菌和产气杆菌？答：有吲哚试验、柠檬酸试验、

V.P.试验和甲基红试验等。

能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚。

将培养基中糖先分解成丙酮酸，

吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，丙酮酸再分解成甲酸、

就

吲哚实验:有些细菌含有色氨酸酶，

，用擦镜纸将测微尺擦拭

10~20个

（观察时光线不宜过强，否则难以找到镜台测微尺

的刻度，换高倍镜标定时，务必十分细心，防止接物镜压坏镜台测微尺和损坏镜头）

10μｍ，根据下列公式即可分别计算出在不同放大倍数下，接目测微尺每

（使接目

换上专用目镜。如果没有专用的目镜，

则取下显微镜的目镜，

旋下透镜，

下放在接目镜的隔板上，再旋上目镜透镜，将装有测微尺的目镜装回镜筒。

其中央有精确的等分刻度，

有等分为50小格和100

会形成红色的玫瑰吲哚。大肠杆菌吲哚反应阳性，产气杆菌阴性。

甲基红试验。某些细菌在糖代过程中，因而使培养基变酸，用甲基红指示剂

乙酸、乳酸等，

[pH4.2（红色）—6.3（黄色）]，可使培养基由原来的桔黄色变为红色，即

甲基红阳性反应。大肠杆菌为阳性反应，产气杆菌为阴性反应。

V.P.试验：某些细菌可利用葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进行缩合，脱羧变成乙酰甲基甲醇，此物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。

二乙酰与蛋白胨中的精氨酸的胍基作用，

V.P.反应阳性，大肠杆菌

生成红色化合物，即V.P.反应阳性，

没有红色化合物产生则为阴性。产气杆菌

V.P.反应阴性。

pH升高，在有１％溴麝香草酚蓝指示剂的情况pＨ小于6.0时呈黄色，pＨ在6.0-7.6时为绿色，pＨ

柠檬酸盐试验：有些细菌能利用柠檬酸钠作为碳源，例如产气杆菌；而另一些细菌不能利用柠檬酸钠，例如大肠杆菌。细菌在分解柠檬酸盐后，产生碱性化合物，使培养基下，培养基由绿色变为深蓝色。溴麝香草酚蓝的指示围为：大于7.6时呈蓝色。

9简述移液管使用方法和注意事项

1、使用前：使用移液管，首先要看一下移液管标记、准确度等级、刻度标线位置等。使用移液管前，应先用铬酸洗液或蒸馏水润洗，以除去管壁的油污。然后用自来水冲洗残确保所移取溶液的浓度不变。

2、吸液：用右手的拇指和中指捏住移液管的上端，将管的下口插入欲吸取的溶液中，插入不要太浅或太深，一般为10～20mm处，太浅会产生吸空，把溶液吸到洗

耳球弄脏溶液，太深又会在管外沾附溶液过多。左手拿洗

入该管

耳球，先把球中空气压出，再将球的尖嘴接在移液管上口，慢慢松开压扁的洗耳球使溶液吸入管，先吸

容量的1/3左右，用右手的食指按住管口，取出，横持，并转动管子使溶液接触到刻度以上部位，以置换壁的水分，然后将溶液从管的下口放出并弃去，按住管口。

3、调节液面：将移液管向上提升离开液面，管的末端仍靠在盛溶液器皿的壁上，管身保持直立，略为放松食指（有时可微微转动吸管）使管溶液慢慢从下口流出，

直至溶液的弯月面底部与标线相切为止，立即用食指压紧

30°，移液管直立，管下端紧靠锥形瓶壁，稍松开

中并未包

管口。将尖端的液滴靠壁去掉，移出移液管，插入承接溶液的器皿中。4、放出溶液：承接溶液的器皿如是锥形瓶，应使锥形瓶倾斜食指，让溶液沿瓶壁慢慢流下，全部溶液流完后需等括这部分残留溶液

。

15s后再拿出移液管，以便使附着在管壁的部分溶液得以流

如此用反复洗

3次后，即可吸取溶液至刻度以上，立即用右手的食指

留的洗液，再用蒸馏水洗净。洗净后的移液管

2至3次，以

壁应不挂水珠。移取溶液前，应先用滤纸将移液管末端外的水吸干，然后用欲移取的溶液涮洗管壁

出。如果移液管未标明“吹”字，则残留在管尖末端的溶液不可吹出，因为移液管所标定的量出容积

1．移液管(吸量管)不应在烘箱中烘干。2．移液管(吸量管)不能移取太热或太冷的溶液。3．同一实验中应尽可能使用同一支移液管。

4．移液管在使用完毕后，应立即用自来水及蒸馏水冲洗干净，置于移液管架上。5．移液管和容量瓶常配合使用，因此在使用前常作两者的相对体积校准。6．在使用吸量管时，为了减少测量误差，每次都应从最上面刻度（的溶液，而不是需要多少体积就吸取多少体积。

7、检查移液管的管口和尖嘴有无破损

,若有破损则不能使用。

8如果移液管上标有“吹”字，则最后残留在管的液滴必须吹出。

9如果移液管是从不能确认洁净的移液管架上所取；不能确认洁净的移液管，应清洗移液管。10使用完移液管，清洗移液管外壁，再放回洁净的移液管架。11清洗、移液过程中溶液不要滴到桌面、地面。10如何制作斜面培养基

,简述具体步骤并说明注意事项

答：具体步骤：1.玻璃器皿洗涤并包扎灭菌。

2.固体培养基的配置：先将配好的液体培养基加热煮沸，

0刻度）处为起始点，往下放出所需体积

再将称好的琼脂（1.5%-2.0%）加入，并使用玻璃棒搅拌，

以免糊底烧焦。加热使琼脂融化，最后补足因蒸发而失去的水分。

3.分装培养基：去玻璃漏斗，装铁架台上，漏斗下连橡皮管，再连玻璃管。倒入培养基并使其流入试管，装入量为管高的1/5。注意不要使培养基沾污管口，造成污染。

4.制作棉塞：选用大小、厚薄适中的棉花，塞入试管口，应紧贴管壁，不留缝隙，以棉塞塞后，将试管捆成一捆，外面包上一层牛皮纸。标记培养基名称及配置日期。4.培养基灭菌：分装好的培养基进行高压蒸汽灭菌。

5.制作斜面：灭菌后的培养基趁热置于木棒或玻棒上，使成适当斜度，凝固后即成斜面，斜面长度不超试管长度1/2为宜。

2/3在管为宜。塞好棉

2007微生物实验操作复试

1哪些方法可以提高视野中光的强弱？

答：显微镜的光学系统中有反光镜、激光器、光源等。

（1）反光镜：装在镜座上面，可向任意方向转动，它有平、凹两面，其作用是将光源光线反射到聚光器上，再经通光孔照明标本，

凹面镜聚光作用强，

适于光线较弱的时候使用，

平面镜聚光作用弱，

适于光线较强时使用。

（2）聚光镜：位于载物台的下方，由两个或几个透镜组成，其作用是将由光源来的光线聚成一个锥形光柱。通过调节聚光镜调旋钮，可以调节光的强弱；聚光器还附有虹彩光圈，调节锥形光柱的角度和大小，从而控制进入

物镜的光的量，从而调节光的强弱。

（3）光源：日光和灯光均可作为光源。通过使用不同的光源改变视野中光的强弱。2用美蓝染色法对酵母细胞进行死活鉴别时为什么要控制染液的浓度和染色时间？

答：美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新代作用，细胞具有较强的还原性，能使美蓝由蓝色的氧化型变成为无色的还原型。因此，具有还原性的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代作用微弱的老龄细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行辨别。加入美蓝浓度高了或染色时间太长了，代不太活泼的活细胞也会被染色，从而使视察到的死细胞较多，活细胞较少；反之，则代微弱的细胞也能还原美蓝，不被染色，从而使观察到的死细胞较少，活细胞较多。

2008微生物实验操作复试2009微生物实验操作复试

2高压蒸汽灭菌为什么比干热灭菌要求温度低、时间短？答：湿热灭菌比敢惹灭菌效果好，主要原因有①

.在湿热灭菌中菌体吸收水分，蛋白质容易凝固变性，蛋白质随着

含水量的增加，所需凝固温度降低；湿热灭菌中蒸汽的穿透力比干燥空气大；蒸汽在被灭菌物体表面凝结，释放出大量的汽化潜热，能迅速提高灭菌物体表面的温度，从而增加灭菌效力。因此，高压蒸汽灭菌为什么比干热灭菌要求温度低、时间短。

3革兰氏染色液成分以及各种成分的作用答：①.革兰氏染色液成分：结晶紫染液，碘液，作用：结晶紫染液：使细胞被染成蓝紫色。

碘液：作为媒染剂，能与结晶紫结合形成复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。95%乙醇：乙醇可以使细胞壁脱水，类脂溶解，从而增加了细胞壁的通透性，结晶紫

出。

番红：使细胞被染成红色。

4如何测量大肠杆菌大小？

9 为使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个步骤？

1 无菌操作

2 稀释良好，不会太浓或太稀。