6．今制得酶浓度相同、底物浓度不同的几个反应混合液，并测得反应初速率，数据见下表。请利用“Eadie-Hofstee”方程式，用图解法求出Km值及Vmax值。这种作图法与Lineweaver-Burk作图法比较
-1-1-5-1
有何优点？[Vmax=160μmolL min,Km=8.0×10 molL]
[S]/molL 4.0×10
-4
2.0×10
-4
1.0×10
-5
5.0×10
-5
4.0×10
-5
2.5×10
-5
2.0×10
-4-1
V/μmolLmin
130 110 89 62 53 38 32
-1-1
解：将米氏方程改写成：V=Vmax-Km·V/[S],以V-V/[S]作图，得一直线，其纵截距为Vmax，斜率为-Km，
-1-1-5-1
由图得Vmax=160μmolLmin,Km=8.0×10 molL
优点：实验点相对集中于直线上，Km和Vmax测定值较准确。
7.对一个遵从米氏方程的酶来说，当底物浓度[S]=Km，竞争抑制剂浓度[I]=Ki时，反应的初速率是多少？[V=1/3Vmax]
解：根据米氏方程可得：V=Vmax[S]/ (Km(1+[I]/Ki)+[S]),其中[S]=Km，[I]=Ki
V= VmaxKm/ (Km(1+Ki/Ki)+Km)=1/3 Vmax
-5
8.用下列表中数据确定此酶促反应：（1）无抑制剂和有抑制剂的Vmax和Km值。[无抑制剂时Km=1.1×10
-1-1-1-5-1-1-1
molL，Vmax=50μmolLmin，有抑制剂时：Km=3.1×10 molL，Vmax=50μmolLmin]（2）EI复合物
-3-1
的解理常数Ki。[Ki= 1.10×10molL]
[S]/molL 无抑制剂 0.3×10 -50.5×10 -51.0×10 -53.0×10 -59.0×10 -5-1V/μmolLmin 有抑制剂（2.0×10 molL） 4.1 6.4 11.5 22.6 33.8 -5-1-3-1-1-110.4 14.5 22.5 33.8 40.5 解：（1）无抑制剂时：V=Vmax[S]/(Km+[S])，将表中数据代入此式可得Km=1.1×10 molL，Vmax=45.1
-1-1
μmolLmin
对表中数据用V对[S]作图，求Km值，可判断有抑制剂时，Km值明显增大，故该抑制剂应为竞争性抑
-1-1
制剂。据V=Vmax[S]/(Km(1+[I]/Ki)+[S])以及Vmax不变的性质可得，此时Vmax=45.1μmolLmin，Km=3.1
-5-1-3-1
×10 molL，Ki= 1.10×10molL
9．同上。
-3
10.从速率对底物浓度作图9-31中，求出下列参数（反应混合物中酶量为10μmol）。（1）Km；（2）Vmax；
-4-1-1-15-1-1
（3）kcat/Km；(4)转换数。[Km:5×10molL；Vmax:6μmolLmin；kcat/Km: 2×10 molLs；转换
-1
数:100s]
解：Vmax=kcat·[Et]=k3·[E]=k3·[ES]
-1-1
11.下面的叙述哪一个是正确的？胰凝乳蛋白酶的转换数100s，DNA聚合酶是15s。
26
（1） （2） （3） （4）
胰凝乳蛋白酶结合底物比DNA聚合酶有更高的亲和性。 胰凝乳蛋白酶反映速率比DNA聚合酶反映速率更大。
在特别的酶浓度和饱和底物水平下胰凝乳蛋白酶反应速率比DNA聚合酶在相同条件下更低。 在饱和底物水平下，两种酶的反应速率，假若DNA聚合酶反应速率的6.7倍则与胰凝乳蛋白酶相等。 答：（4）正确。原因：Ks=K-1/K1 为酶与底物亲和性的度量；只有在饱和底物水平下，才有Kcat=Vmax/[E]。
-6-1-1
12.今有一酶反应，它符合Michaelis-Menten动力学，其Km为1×10molL。底物浓度为0.1 molL时，
-1-1-2-1-3-1-6-1
反应初速度为0.1μmolLmin。试问：底物浓度分别为10molL、10molL和10molL时的反应初速率
-7-1-1-8-1-1
是多少？[1×10 molLmin，5×10 molLmin]
-6-1-1-1-1
解：∵Km=1×10molL，[S]=0.1molL ，∴V=Vmax=0.1μmolLmin
将题中数据代入米氏方程：V=Vmax[S]/(Km+[S])得：设[S]=xKm V=Vmax·xKm/((x+1)Km)=x/(x+1)·Vmax=1/(1+1/x)·Vmax V1=0.1 V2=0.09998 V3=1/2·Vmax=0.05
-4-1-5
13．假设2×10 molL的[I]抑制了一个酶催化反应的75%，计算这个非竞争性抑制剂的Ki？[6.66×10
-1
molL]
解：i%=（1-a）×100%=（1-Vi/Vo）×100%=75% Vi/Vo=1/4 → Vo=4Vi??①
再根据无抑制剂时的米氏方程：Vo=Vmax[S]/(Km+[S])??②
加入非竞争性抑制剂后：V=Vˊmax[S]/((Km+[S])(1+[I]/Ki))??③，此时Vmax变小，Km不变。
-4
由①②③得：Ki=2×10/（4·Vˊmax/ Vmax-1）
-5-1
加入抵制剂时，Vˊmax = Vmax，∴Ki=6.66×10 molL
-4-1-5-3
14.如果Km为2.9×10 molL 。Ki为2×10mol/L。在底物浓度为1.5×10mol/L时，要得到75%的抑
-4
制，需竞争性抑制剂的浓度是多少？[3.7×10mol/L]
解：i%=（1-a）×100%=（1-Vi/Vo）×100%=75% Vi/Vo=1/4 → Vo=4Vi??①
再根据无抑制剂时的米氏方程：Vo=Vmax[S]/(Km+[S])??②
加入竞争性抑制剂后：V=Vˊmax[S]/(Kˊm(1+[I]/Ki) +[S])??③，此时Vmax不变，Km变大。 由①②③得：[I]=4KmKi/Kˊm-Ki+3[S][Ki]/Kˊm
-4
加入抑制剂时，Km=Kˊm ∴[I]= 3.7×10mol/L
15.举例说明什么是Ks型和kcat型不可逆抑制剂。什么是过度态底物类似物？它属于何种类型抑制剂？
答：Ks型抑制剂根据底物的化学结构设计，具有底物类似的结构，可以和相应的酶结合，同时还代有一个活泼的化学基团，能与酶分子中的必需基团反应进行化学修饰，从而抑制酶。因其专一性取决于抑制剂与活性部位必需基团在反应前形成非共价络合物的解离常数以及非活性部位同类基团形成非共价络合物的解离常数之比，即Ks比值，故这类抑制剂称不可逆Ks抑制剂。例如：胰蛋白酶要求催化的底物具有一个带正电荷的侧链，如Lys、Arg侧链。对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲酮（TLCK）和胰蛋白酶活性部位必需集团His57共价结合，引起不可逆失活。
Kcat型不可逆抑制剂具有天然底物的类似结构，其本身也是酶的底物，能与酶结合发生类似于底物的变化。但抑制剂还有一个潜伏的反应基团，当酶对它进行催化反应时，这个潜伏反映基团被暴露或活化，并作用于酶活性部位的必需基团或酶的辅基，使酶不可逆失活，其专一性极高。例如β-卤代-D-Ala是细菌中丙氨酸消旋酶（AR）的不可逆抑制剂，属于磷酸吡哆醛类的自杀性底物。
过渡态底物类似物是化学结构类似过渡态底物（底物和酶结合成中间复合物后被活化的过渡形式）的抑制剂，属于竞争性抑制剂，如嘌呤腺苷水合形成是小牛脱氨酶反应过渡类似物。
27
第十章 酶的作用机制和酶的调节
提要
酶的活性部位对于不需要辅酶的酶来说，就是指酶分子中在三维结构上比较靠近的几个氨基酸残基负责与底物的结合与催化作用的部位，对于需要辅酶的酶来说，辅酶分子或辅酶分子上的某一部分结构，往往也是酶活性部位的组成部分。酶活性部位有6个共同特点。研究酶活性部位的方法有：酶分子侧链基团的化学修饰法，动力学参数测定法，X射线晶体结构分析法和定点诱变法，这些方法可互相配合以判断某个酶的活性部位。
酶是催化效率很高的生物催化剂，这是由酶分子的特殊结构所决定的。经研究与酶催化效率的有关因素有7个，即底物和酶的邻近效应与定向效应，底物的形变与诱导契合，酸碱催化，共价催化，金属离子催化，多元催化和协同效应，活性部位微环境的影响。但这些因素不是同时在一个酶中其作用，也不是一种因素在所有的酶中起作用，对于某一种酶来说，可能分别主要受一种或几种因素的影响。
研究酶催化的反应机制，始终是酶学研究的一个重点，通过大量的研究工作，已经对一些酶的作用机制有深入了解，该章对溶菌酶、胰核糖核酸酶A、羧肽酶A、丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶等的催化作用机制进行了详尽的讨论。
酶活性是受各种因素调节控制的，除了在第8章中已介绍的几种因素外，主要还有①别构调节，例如ATCase。②酶原的激活，如消化系统蛋白酶原的激活及凝血系统酶原的激活。③可逆共价修饰调控，如蛋白质的磷酸化，一系列蛋白激酶的作用。通过以上作用，使酶能在准确的时间和正确的地点表现出它们的活性。别构酶一般都是寡聚酶，有催化部位和调节部位，别构酶往往催化多酶体系的第一步反应，受反应序列的终产物抑制，终产物与别构酶的调节部位相结合，由此调节多酶体系的反应速率。别构酶有协同效应，[S]对υ的动力学曲线呈S形曲线（正协同）或表现双曲线（负协同），两者均不符合米氏方程。ATCase作为别构酶的典型代表，已经测定了其三维结构，详细研究了别构机制和催化作用机制。为了解释别构酶协同效应的机制，有两种分子模型受到人们重视，即协同模型和序变模型。酶原经过蛋白水解酶专一作用释放出肽段，构象发生变化，形成酶的活性部位，变成有活性的酶，这个活化过程，是生物体的一种调控机制。可逆地共价修饰调控作用是通过共价调节酶进行的，通过其他酶对其多肽链某些基团进行可逆地共价修饰，使处于活性与非活性的互变状态，从而调节酶活性。共价修饰的基团主要是磷酸化、腺苷酰化、尿苷酰化及ADP-核糖基化等。
同工酶是指催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构、理化性质和免疫性能等方面不同的一组酶。同工酶是研究代谢调节、分子遗传、生物进化、个体发育、细胞分化和癌变的有力工具，在酶学、生物学及医学研究中占有重要地位。LDH同工酶研究的比较清楚，是由两种不同亚基组成的四聚体，有5种同工酶，在不同组织中含量不同，反映了同工酶的组织特异性。
习题
1.阐明酶活性部位的概念。可使用那些主要方法研究酶的活性部位？
答：酶的活性部位对于不需要辅酶的酶来说，就是指酶分子在三维结构上比较靠近的几个氨基酸残基负责与底物的结合与催化作用的部分；对于需要辅酶的灭来说，辅酶分子或辅酶分子上的某一部分结构，往往也是酶活性部位的组成部分。
研究酶活性部位的方法有：酶分子侧链基团的化学修饰法、动力学参数测定法、X射线晶体结构分析法和定点诱变法。
2.简要阐明胰Rnase A的活性部位如何确定？
答：用化学修饰法研究Rnase A活性的必须氨基酸残基。在pH5.5下，用等摩尔碘乙酸处理Rnase A，羧甲基化的His119是主要产物，而羧甲基化的His12产物较少。Rnase A中其他组氨酸对这个试剂的反应弱得多。所得Rnase A的两个羧甲基化的衍生物均无活性，因此可推测His119和His12为酶活性的必需基团。2，4二硝基氟苯可选择地同酶Lysε-NH2反应，酶引起失活。该结果表明Lys41也是酶活性部位的必需氨基酸。以上研究结果可认为His119、His12、Lys41构成了Rnase A的活性部位。
28
3.与酶催化效应有关的因素有哪些？它们是怎样提高反应速率的？
答：与酶催化速率有关的因素有7个：
1. 底物和酶的邻近效应与定向效应：酶和底物复合物的形成过程既是专一性的识别过程，更重要的是分子间反应变成分子内反应的过程。在这一过程中包括两种效应、邻近效应和定向效应。邻近效应是指酶与底物结合形成中间复合物以后，使底物和底物（如双分子反应）之间，酶的催化基团与底物之间结合于同一分子而使有效浓度得以极大的升高，从而使反应速率大大增加的一种效应。定向效应是指反应物的反应基团之间和酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确取位产生的效应。
2. 底物的形变和诱导契合：当酶遇到其专一性底物时，酶中某些基团或离子可以使底物分子内敏感键中的某些基团的电子云密度增高或降低，产生“电子张力”，使敏感键的一端更加敏感，底物分子发生形变，底物比较接近它的过渡态，降低了反应活化能，使反应易于发生。
3. 酸碱催化：通过瞬时的向反应物提供质子或从反应物接受质子以稳定过渡态，加速反应的一类催化机制。
4. 共价催化（亲核催化或亲电子催化）：在催化时，亲核催化剂或亲电子催化剂能分别放出电子或吸取电子并作用于底物的缺电子中心或负电中心，迅速形成不稳定的共价中间复合物，降低反应活化能，使反应加速。
5. 金属离子催化： 金属离子以3种主要途径参加催化过程：（1）通过结合底物为反应定向；（2）通过可逆地改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应；（3）通过静电稳定或屏蔽负电荷，作用比质
+
子强，不少金属离子有络合作用，并且在中性pH溶液中，H浓度很低，但金属离子却容易维持一定浓度。金属离子通过电荷的屏蔽促进反应。金属离子通过水的离子化促进亲核催化。
6. 多元催化和协同效应：酶催化反应中常常几个基元催化反应配合在一起共同起作用，加速酶反应。 7. 活性部位微环境的影响：在酶分子的表面有一个裂缝，而活性部位就位于疏水环境的裂缝中，大大有利于酶的催化作用。
4.推测下列寡聚糖被溶菌酶水解的相对速率：（G：N-乙酰氨基葡糖；M：N-乙酰氨基葡糖乳酸） （1）M-M-M-M-M-M；（2）G-M-G-M-G-M；（3）M-G-M-G-M-G
1818
5.假设在合成（NAG）时D和E糖残基之间的糖苷氧已为O所标记，当溶菌酶水解时，O将出现在哪个产物中？
18
答：溶菌酶催化C1-O键断裂，故O将出现在由A、B、C、D残基组成的四聚体中。
6.请比较溶菌酶、羧肽酶A、胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶：（1）哪一种酶的催化活性需要金属离子？（2）哪种酶只含一条多肽链？（3）哪种酶被DFP迅速地失活？（4）哪种酶是由酶原激活成的？
答：（1）羧肽酶A；（2）溶菌酶；（3）胰凝乳蛋白酶；（4）羧肽酶A、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶。
7.上题4种酶的催化机制中是否有从酶到底物的质子转移过程？若有请指出它们的质子供体是什么？
++
答：溶菌酶中的Glu35的-COOH提供一个H；羧肽酶A中的Glu270的-COOH提供一个H；胃蛋白酶中的
++
Asp32的-COOH提供一个H；胰凝乳蛋白酶中Ser195提供一个H。
8.TPCK是胰凝乳蛋白酶的亲和标记试剂，它对His57烷基化后使胰凝乳蛋白酶失活。（1）为胰蛋白酶设计一个像TPCK那样的亲和标记试剂。（2）你认为怎样可以检验它的专一性？（3）能被胰蛋白酶的这个亲和标记试剂失去活性的还有哪个丝氨酸蛋白酶？
9.胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和弹性蛋白酶作为催化剂有哪些相似之处？有哪些不同之处？在酶的分子结构上是哪些因素引起这些差异？
答：相似之处：①执行相同的反应——裂解肽键；②其结构和作用机制很相似；③相对分子质量范围
29
在2.5×10，并且具有相似的顺序和三级结构；④3个极性残基——His57、Asp102和Ser195在活性部位形成催化三联体。
不同之处：①专一性不同：胰蛋白酶裂解碱性氨基酸Arg和Lys羧基侧链肽；胰凝乳蛋白酶选择裂解芳香氨基酸如Phe和Tyr羰基侧链；弹性蛋白主要裂解小的中性氨基酸残基羰基侧链肽；②酶活性部位不同：胰蛋白酶口袋中，有一个负电荷Asp189在底部，有利于结合正电荷Arg和Lys残基；胰凝乳蛋白酶口袋被疏水氨基酸环绕，大的足以容纳一个芳香残基；弹性蛋白口袋浅，开口处具有大的Thr和Val残基，仅小的，部大的残基能够容纳在它的口袋中。
10.ATCase是一种别构酶，其活性部位与别构效应物结合部位分别处于不同亚基之上，有可能设想别构酶上这两种部位存在于同一亚基上吗？为什么？
11.对于ATCase来说，琥珀酸起着Asp（两个底物中的一个）的竞争抑制作用。υ对[Asp]的依赖关系见图10-71A（假设这些实验中第二种底物是过量的并可忽略）。在图10-71B种[Asp]维持在低水平（图10-71A种箭头所指处）不变，并加入一系列含量递增的琥珀酸。琥珀酸不能作为底物参与反应。请解释这些结果。
3
答：琥珀酸的结合导致协同由T型向R型转变。
12.试解释为什么胰凝乳蛋白不能像胰蛋白酶那样自我激活？
答：胰凝乳蛋白酶无法断裂Arg15羧基端肽键，故无法自我激活；而胰蛋白酶专一断裂碱性氨基酸羧基端肽键，故可断裂Lys6羧基端肽而自我激活。
13.羧肽酶A促使底物的水解，下面哪个是其重要的机制：（1）结构重排将必需氨基酸残基靠近敏感键。（2）
2+
形成一个C端环肽的共价中间物。（3）活性部位Try残基脱质子形成亲核作用。（4）通过结合Zn的活化水。 答：（4）正确。
14.左边列出的每一种酶，按照提出的催化机制，从右边选择出它们适当的过渡态或化学本质。 （1）溶菌酶——（4） （2）RNA酶——（3） （3）羧肽酶A——（1） （4）胰凝乳蛋白酶（2）（5） （5）胃蛋白酶——（6） （1）Zn的活化水 （2）氧阴离子 （3）五价磷 （4）碳正离子 （5）四面体肽键 （6）天冬氨酸——活化水 2+ 5.对蛋白酶激A的叙述中哪一个是正确的？ （1） 通过ATP活化。
（2） 在没有激活剂时有2个催化亚基（C）和两个调节亚基（R）组成。 （3） 激活剂结合后解离成一个C2和2个R亚基。 （4） 在C亚基中含有一个假底物顺序。
30
生物化学王镜岩（第三版）课后习题解答全
