肿瘤抑制基因XAF1在耐药肺腺癌细胞中表达的初步研究
【摘 要】目的：研究肿瘤抑制基因xaf1在耐药肺腺癌中的表达，探讨xaf1在肺腺癌耐药发生、发展中的作用，为基因治疗耐药肺腺癌提供理论依据。方法：本研究培养人非小细胞肺癌顺铂耐药细胞株a549/ddp和其亲本株a549，通过mtt法测定a549/ddp对顺铂的耐药指数；采用半定量逆转录-聚合酶链式反应（rt-pcr）检测两种细胞及凋亡细胞（顺铂作用48h后的a549细胞）中xaf1、xiap mrna的表达水平变化。结果：a549和a549/ddp细胞对顺铂的ic50分别为5.52±0.12?mol/l、34.96±0.74?mol/l，因此，a549/ddp对顺铂的耐药指数为34.96/5.52=6.33，确定为耐顺铂的非小细胞肺癌细胞；rt-pcr结果显示a549/ddp细胞较正常a549细胞xaf1 mrna表达水平下调（pa549/ddp细胞对ddp的耐药指数=顺铂对a549/ddp细胞的ic50/顺铂对其亲本敏感细胞株a549细胞的ic50，即34.96?mol/l /5.52?mol/l=6.33。所以a549/ddp细胞确定为耐顺铂的肺癌细胞株，适合进行进一步的肺癌耐药相关机制研究。
表1 顺铂对a549细胞的增殖的影响（x±s，n=6） 浓度 0?mol/l 1.25?mol/l 2.5?mol/l 5?mol/l 7.5?mol/l 10?mol/l
od值 1.013±0.012 0.901±0.016 0.800±0.025 0.473±0.017 0.302±0.014 0.087±0.011
ir（%） 0 11.04±0.02 21.01±0.03 53.33±0.02 70.19
±0.02 91.41±0.01
表2 顺铂对a549/ddp细胞的增殖的影响（x±s，n=6） 浓度 0?mol/l 10?mol/l 20?mol/l 30?mol/l 40?mol/l 50?mol/l
od值 1.041±0.015 0.851±0.008 0.705±0.016 0.582±0.013 0.383±0.017 0.265±0.016
ir（%） 0 18.25±0.01 32.26±0.02 44.09±0.01 63.20±0.02 74.55±0.02
二、rt-pcr检测a549及a549/ddp细胞的xaf1、xiap mrna表达情况
rt-pcr结果显示：a549/ddp细胞组较正常a549细胞组xaf1 mrna表达水平下调（p【关键词】人肺腺癌顺铂耐药细胞株a549/ddp；xiap相关因子1；细胞凋亡
【中图分类号】r655 【文献标识码】a 【文章编号】1004-7484（2013）03-0038-02 材料与方法 一、材料
人非小细胞肺癌a549细胞株属我院实验室保存，来源于中国科学院上海细胞生物学研究所；人非小细胞肺癌耐顺铂细胞株a549/ddp细胞株购自中南大学湘雅医学院细胞中心（北京大学肿瘤临床学院建系，其亲本细胞a549来源于atcc）；ddp购自山东齐鲁制药有限公司（10mg/支，批号h20023460）；四甲基偶氮唑蓝（mtt）
（sigma公司）；trizol试剂（invitrogen 公司）；逆转录试剂盒（fermentas公司）；特异性引物（上海生工生物工程技术服务有限公司）。 二、方法
1 细胞培养 人非小细胞肺癌a549细胞培养在dmem（含10%小牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素）培养液中，人非小细胞肺癌耐顺铂细胞株a549/ddp细胞培养在含有2mg/l ddp的dmem培养基中，置37℃、饱和湿度、含5à2和95%空气的恒温培养箱中培养，隔2-3天换液一次，定期传代，进行试验前1周更换为不含ddp的dmem培养基以减少ddp对实验的干扰，全部实验均采用指数生长期的a549细胞和a549/ddp细胞。
2 mtt法测定a549/ddp细胞的耐药指数 取对数生长期的a549和a549/ddp细胞，用胰蛋白酶消化，调整细胞密度接种于无菌96孔板中，每孔200ul（细胞数约为5×103）。每组设6个复孔。根据预实验结果，a549细胞分别加入ddp终浓度为0?mol/l、1.25?mol/l、2.5?mol/l、5?mol/l、7.5?mol/l、10?mol/l的dmem培养基，a549/ddp细胞分别加入ddp终浓度为0?mol/l、10?mol/l、20?mol/l、30?mol/l、40?mol/l、50?mol/l的dmem培养基，继续培养，每24h换液一次，浓度同前，培养至44小时时取出96孔板，根据试剂盒说明书行mtt检测，并计算不同浓度的ddp对a549细胞和a549/ddp细胞的生长抑制率。然后根据spss17.0软件得出a549细胞和a549/ddp细胞对ddp的ic50值。耐药指数又称耐药倍
肿瘤抑制基因XAF1在耐药肺腺癌细胞中表达初步
