血管(或粗针头),再将近心端的丝线结扎固定于放血管上,以防放血管滑脱。松开血管夹,使血液流入灭菌三角烧瓶中,一般一只家兔可放血80-100ml。
5. 免疫血清的提取与保存
将心脏抽取的血液立即注入无菌的大平皿中,置37℃温箱2h,凝固后用细针头沿平皿边缘将血块与皿壁脱离,再将血块划成豆腐块,然后放入4℃冰箱过夜,使血清充分析出。三角烧瓶中的血液先放37℃温箱2h,用细玻棒将血块与瓶壁剥离,4℃冰箱过夜,使血清充分析出。若血清中带有红细胞或小的血凝块,则须离心沉淀,去掉红细胞和血凝块。将血清按1:100的比例加入1% 硫柳汞,分装于灭菌的小瓶内,封口,贴上标签,注明免疫血清的名称,效价及制备日期,放置低温冰箱中保存备用。
(二)抗布氏杆菌抗体的制备,
1. 含油佐剂的布氏杆菌菌体抗原(免疫原)的制备
(1) 油相:白油与司本80按94:6的比例混合后,加2%硬脂酸铝融化混匀,116?C高压蒸汽灭菌30 min后即为油相。
(2) 水相:布氏杆菌病试管凝集抗原溶液与吐温80(已灭菌)按96:4的比例混合后即为水相。
(3) 乳化:油相(放至室温后)与水相按1:1比例混合。先将油相倾入组织捣碎机内,在低速搅拌下缓缓加入水相,然后继续加速搅拌而成油乳剂苗。
(3) 稳定性检验:将制好的含佐剂抗原,于半径为10cm的离心器中,以3000r/min离心15min,没有发生分层,可以判断其性质稳定。
2. 不含佐剂的布氏杆菌菌体抗原(免疫原)的制备
布氏杆菌病试管凝集抗原与生理盐水按48:52的比例混合,即为不含佐剂的布氏杆菌菌体抗原,改免疫原所含抗原量与佐剂抗原的抗原量相同。
3. 家兔免疫程序
(1) 程序1:选用体重2~3 ㎏ 的健康家兔(最好雄性),先饲养观察7天。将含佐剂抗原或不含佐剂抗原于家兔背部皮内多点注射,免疫时间是第1、8、15天,免疫剂量分别是:、、,末次免疫后7d采血。
(2) 程序2:选用体重2~3 ㎏ 的健康家兔(最好雄性),先饲养观察7天。将含佐剂抗原或不含佐剂抗原于家兔背部皮内多点注射,免疫时间是第1、8、15天,免疫剂量分别
是: 、、,末次免疫后7d采血。
4. 抗血清效价的测定
用布氏杆菌试管凝集试验(参见实验一中的布氏杆菌试管凝集试验操作方法)对抗血清进行凝集效价的测定。用“+”表示颗粒性抗原的凝集程度,以出现“+”的最高抗血清稀释度判定为凝集效价,凝集效价一般可达到1:400以上。
[思考题]
1. 家兔在免疫前为什么先饲养观察7天? 2. 制备溶血素时,免疫原为什么不用加佐剂?
3. 你还有其它的制备溶血素或抗菌抗体的免疫程序么?
动物免疫学实验指导
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