血管（或粗针头），再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱。松开血管夹，使血液流入灭菌三角烧瓶中，一般一只家兔可放血80-100ml。
5. 免疫血清的提取与保存
将心脏抽取的血液立即注入无菌的大平皿中，置37℃温箱2h，凝固后用细针头沿平皿边缘将血块与皿壁脱离，再将血块划成豆腐块，然后放入4℃冰箱过夜，使血清充分析出。三角烧瓶中的血液先放37℃温箱2h，用细玻棒将血块与瓶壁剥离，4℃冰箱过夜，使血清充分析出。若血清中带有红细胞或小的血凝块，则须离心沉淀，去掉红细胞和血凝块。将血清按1:100的比例加入1% 硫柳汞，分装于灭菌的小瓶内，封口，贴上标签，注明免疫血清的名称，效价及制备日期，放置低温冰箱中保存备用。
（二）抗布氏杆菌抗体的制备，
1. 含油佐剂的布氏杆菌菌体抗原（免疫原）的制备
(1) 油相：白油与司本80按94:6的比例混合后，加2％硬脂酸铝融化混匀，116?C高压蒸汽灭菌30 min后即为油相。
(2) 水相：布氏杆菌病试管凝集抗原溶液与吐温80（已灭菌）按96:4的比例混合后即为水相。
(3) 乳化：油相（放至室温后）与水相按1:1比例混合。先将油相倾入组织捣碎机内，在低速搅拌下缓缓加入水相，然后继续加速搅拌而成油乳剂苗。
(3) 稳定性检验：将制好的含佐剂抗原，于半径为10cm的离心器中，以3000r/min离心15min，没有发生分层，可以判断其性质稳定。
2. 不含佐剂的布氏杆菌菌体抗原（免疫原）的制备
布氏杆菌病试管凝集抗原与生理盐水按48:52的比例混合，即为不含佐剂的布氏杆菌菌体抗原，改免疫原所含抗原量与佐剂抗原的抗原量相同。
3. 家兔免疫程序
(1) 程序1：选用体重2～3 ㎏ 的健康家兔(最好雄性)，先饲养观察7天。将含佐剂抗原或不含佐剂抗原于家兔背部皮内多点注射，免疫时间是第1、8、15天，免疫剂量分别是：、、，末次免疫后7d采血。
(2) 程序2：选用体重2～3 ㎏ 的健康家兔(最好雄性)，先饲养观察7天。将含佐剂抗原或不含佐剂抗原于家兔背部皮内多点注射，免疫时间是第1、8、15天，免疫剂量分别
是： 、、，末次免疫后7d采血。
4. 抗血清效价的测定
用布氏杆菌试管凝集试验（参见实验一中的布氏杆菌试管凝集试验操作方法）对抗血清进行凝集效价的测定。用“+”表示颗粒性抗原的凝集程度，以出现“＋”的最高抗血清稀释度判定为凝集效价，凝集效价一般可达到1:400以上。
[思考题]
1. 家兔在免疫前为什么先饲养观察7天？ 2. 制备溶血素时，免疫原为什么不用加佐剂？
3. 你还有其它的制备溶血素或抗菌抗体的免疫程序么？
动物免疫学实验指导
