9. 结果判定：以酶标仪检测样品的OD值（波长490nm），先以空白孔调零，当OD≥即判断为阳性。
注意: 每块ELISA板均需在最后一排的后3孔设立阳性对照、阴性对照和空白对照。 （二）夹心ELISA（以鸡传染性法氏囊病病毒检测为例）
1. 包被：用包被液将IBDV特异性抗体稀释为25-100?g/ml，以100?L/孔的量加入酶标板中，置4℃过夜吸附或37℃吸附120min。
2. 洗涤：PBST冲洗酶标板，共洗3次，每次3min。
3. 封闭：用封闭液封闭，200?L/孔，4℃过夜或37℃ 120min；PBST洗3次，每次1min。 4. 加待检IBDV抗原：每孔加100?L 待检IBDV抗原，同时设立阴、阳性对照，37℃孵育45-90min ；PBST洗3次，每次3min。
5. 加酶标抗体：每孔加100?L酶标鼠抗IBDV的单抗，37℃孵育45-90min ；PBST洗3次，每次5min。
6. 加底物溶液：每孔加底物溶液（OPD和 H2O2）100?L ，37℃避光作用20min。 8. 终止反应：每孔加2mol/L H2SO4溶液50?L终止反应。
9. 结果判定：在酶标仪上读取OD值（波长490nm），当OD≥，并且P/N≥，为阳性。 [思考题]
1. 免疫酶技术的原理是什么?
2. 间接ELISA和夹心ELISA的操作步骤是什么？ 3. 猪群猪瘟抗体监测对指导猪瘟免疫有何实际意义?
实验九 荧光抗体技术
荧光抗体技术是指用荧光素对抗原或抗体进行标记，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。该技术将血清学的特异性和敏感性与显微技术的精确性结合起来，解决了生物学上的许多难题，如病毒的侵袭途径及其感染细胞内复制部位的
研究，以及抗体的产生部位等。随着荧光抗体技术的敏感性和特异性的进一步提高，该技术在病原微生物的早期诊断、肿瘤抗原的研究、抗原抗体免疫组化定位等方面得到了广泛应用。 [目的要求]
1. 掌握荧光抗体染色法诊断猪瘟的基本操作步骤。 2. 了解荧光抗体技术的基本原理。 [材料与试剂]
1. 载玻片，盖玻片，冰冻切片机，荧光显微镜， 2. 0.01mol/L PBS（）。
3. 缓冲甘油：优级纯甘油9份和碳酸盐缓冲液1份混合而成。 4. 碳酸盐缓冲液：L 碳酸钠1份与L 碳酸氢钠3份混合。 4. 猪瘟荧光抗体，猪瘟抗血清，病猪的扁桃体或肾脏等。 [操作方法]
1. 切片制备：将冰冻的扁桃体或肾脏进行切片，置载玻片上，空气中自然干燥后，立刻在室温下放入纯丙酮固定15min。
2. 洗涤：将固定好的切片以PBS轻轻漂洗5次，每次3min。
3. 染色：在晾干的标本片上滴加猪瘟荧光抗体（工作浓度），以覆盖为度，放湿盒内置37℃染色30min。
4. 洗涤：取出标本片，以吸管吸PBS冲去玻片中的荧光抗体，然后置大量PBS中漂洗5次，每次3min，再以蒸馏水冲洗晾干。
5. 封载：染色片半干时，滴加缓冲甘油封片。 本试验需设定以下对照：
（1） 阳性对照；含有猪瘟病毒的组织所作的切片； （2） 自发荧光对照，以PBS代替荧光抗体染色；
（3） 抑制试验对照，标本上加未标记的猪瘟抗血清，37℃于湿盒内中30min后，PBS漂洗，再加标记抗体，染色同上。
6. 镜检：将染色后的标本片置荧光显微镜下观察，先用低倍物镜选择适当的标本区，然后换高倍物镜观察。以油镜观察时，可用缓冲甘油代替香柏油。
7. 结果判定
阳性对照应呈翠绿色荧光，而猪瘟自发荧光对照组和抑制试验对照组应无荧光。
阳性结果：扁桃体隐窝上皮细胞或肾曲小管上皮细胞的胞浆内呈明亮的翠绿色荧光，细胞形态清晰。
阴性结果：五荧光或荧光微弱，细胞形态不清晰。
[思考题]
1. 荧光抗体染色法的原理是什么? 2. 荧光抗体技术有何优点?
实验十 多克隆抗体（免疫血清）的制备
免疫血清的制备是一项常用的免疫学实验技术。高效价、高特异性的免疫血清可作为免疫学诊断的试剂，也可供特异性免疫治疗用。用完全抗原物质多次免疫动物，采取血液，分离血清，即为抗血清或免疫血清，该血清中含有多克隆抗体。
具有免疫原性的抗原可刺激机体内相应的B细胞增殖、分化，形成浆细胞并分泌特异性抗体。由于抗原分子表面的不同抗原决定簇（表位）为不同特异性的B细胞克隆所识别，因此由某一抗原刺激机体后产生的抗体，实际上为针对该抗原分子表面不同抗原决定簇的抗体混合物（即多克隆抗体）。另外，根据机体产生免疫应答的特点，需要多次重复注射免疫原，才能产生高效价及高亲和力的抗体。 [目的要求]
1. 掌握免疫血清（溶血素和抗菌抗体）的制备方法。 2. 掌握免疫原的制备方法。
3. 进一步熟悉凝集试验的操作过程及结果观察。 [材料与试剂]
1. 试管，离心管，注射器，平皿，三角烧瓶，
2. 肝素液，Hank’s液，生理盐水，白油，司本80，吐温80，硬脂酸铝等。 3. 布氏杆菌病试管凝集抗原、布氏杆菌病标准阳性血清、布氏杆菌病标准阴性血清，由生物制品厂购买。
4. 鸡红细胞，10% 鸡红细胞，50% 鸡红细胞，鸡，家兔。 [实验内容与操作步骤]
（一）抗鸡红细胞抗体的制备
1、鸡红细胞悬液（免疫原）的制备
从鸡翅下静脉或心脏采血，用肝素抗凝，按抗凝血液的体积，加8-10倍已灭菌的Hank’s液，轻轻摇匀后，置普通离心机离心洗涤3次，每次2000r/min离心10mim，弃上清液后，取压积RBC备用或用无菌Hank’s液分别配成10% RBC悬液和50% RBC悬液，即为免疫原。
2、家兔免疫程序
(1) 程序1：选用体重2～3 ㎏ 的健康家兔，先饲养观察7天。用以Hank’s液洗过3次的压积红细胞进行免疫，每日背部皮下注射1次，共5次，注射量为、、、、。第6次改用静脉注射50% 压积红细胞悬液1ml，1日1次，连注3天。末次注射后7d采血，分离血清，分装，-20℃保存备用。
(2) 程序2：选用体重3～4 ㎏ 的健康家兔，先饲养观察7天。用以Hank’s液洗过3次的压积红细胞进行免疫，第1次，皮内注射，以后隔日注射1次，每次递增，从第2次开始，均为皮内、皮下多点注射，共注射5-7次，末次注射后7d试血，测定红细胞凝集抗体
效价，若达1:2000以上时即可采血，分离血清，分装，-20℃保存备用。
(3) 程序3：选用体重3～4 ㎏ 的健康家兔，先饲养观察7天。用以Hank’s液配制的10% 红细胞进行免疫，第1次，耳静脉注射，每日注射1次，共免疫5次，每次递增，末次注射后7d试血，若红细胞凝集抗体效价达不到1:2000时，用50% 鸡RBC悬液耳静脉注射，加强免疫二次。
(4) 程序4：选体重3～4㎏的健康家兔，先饲养观察7天。用以Hank’s液配制的10% 红细胞进行免疫，第1次，背部皮下注射，每日1次，连续5次，每次递增，第6次耳静脉注射20% 压积红细胞悬液1ml，第7次耳静脉注射30% 压积红细胞悬液1ml，第8次耳静脉注射50% 压积红细胞悬液1ml，1日1次。末次注射后7d采血，分离血清，分装，-20℃保存备用。
3. 抗血清（溶血素）效价的测定
取试管8支，按下表将溶血素稀释并加入红细胞和生理盐水，用“+”表示红细胞凝集程度，以出现“＋”的最高抗血清稀释度判定为溶血素效价。效价达1:2000以上者为合格。
溶血素效价的测定（单位：ml）
分 组 管 号 溶血素稀释倍数
溶血素 1%红细胞 生理盐水
1 10
2 10
2
试 验 组
3 10
3
对照组
5
6
3
4 2×10
3
7
3
8
3
3×10
4×10
5×10
混匀,37℃感作1h
结果判定
++++
++++
++
+
－
－
－
－
4. 家兔采血
（1）心脏采血法：家兔仰卧保定，左胸部剪毛，消毒皮肤。左手固定心脏，右手用50ml注射器（连接16号针头），倾斜45℃，对准心搏动最强处刺入心脏抽血直至死亡。
（2）颈动脉放血法：家兔仰卧保定，头部略放低以暴露颈部，剪毛及消毒皮肤。颈部中线切开皮肤约10cm，分离皮下组织，分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈动脉后并使之游离。于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心端及近心端。结扎远心端，近心端的动脉用血管夹夹住。用小剪刀在两根丝线间的动脉壁上剪一小口，插入塑料放
动物免疫学实验指导
