淋巴细胞分层液表面，置水平转子离心机，2000r/min离心20min，用毛细管吸取血浆与分层液之间的乳白色淋巴细胞层，以Hank’s 液如上洗涤，再以Hank’s液配成细胞数为5×10个/ml的悬液。
3. 方法3
取豚鼠肝素抗凝血2 ml ，置37℃水浴中静置30-40min，吸取上层白细胞与血浆的混合液（约1 ml）；于混合液中加Hank’s液数毫升，1500r/min离心5-10 min，弃上清，重复用Hank’s液洗涤4次，沉淀均匀即为淋巴细胞悬液。
(二) 家兔红细胞（RRBC）的制备
1. 心脏采集家兔肝素抗凝血5 ml ，以2000r/min离心10min，弃上清液。
2. 用Hank’s液反复洗涤红细胞三次，每次2000r/min离心10min ，再以Hank’s液配成10% RRBC悬液。
（三）E-花环形成细胞
1. 取 ml 淋巴细胞悬液，加10% RRBC悬液 ml ，再加小牛血清 ml 。 2. 37℃水浴15min，600r/min离心5min，吸弃上清液，4℃作用2-4h。 3. 将细胞沉淀轻轻摇起，加% 戊二醛溶液 ml ，混匀后4℃固定15 min。 4. 将洁净的载玻片用Hank’s液沾湿，滴一小滴细胞悬液，让其自然散开即可。 5. 自然干燥后，滴加甲醇固定5min，用Giemsa-Weight 染色液染色，水洗，干燥镜检。 6. 结果判断：凡吸附3个以上RRBC的淋巴细胞判为一个E-花环形成细胞。每一标本检查200个淋巴细胞，按下列公式计算E-玫瑰花环形成率。
E-玫瑰花环形成细胞数
E-玫瑰花环形成率 = ×100% 计数的淋巴细胞总数 [思考题]
1. E-玫瑰花环试验的操作方法。
2. 为什么可以用E花环试验检测T细胞的数量？
6
实验六 EA玫瑰花环试验
B淋巴细胞上有免疫球蛋白的Fc受体， 以鸡红细胞作为指示细胞与相应的抗红细胞抗
体形成EA，B淋巴细胞可以通过Fc受体与EA结合，形成EA玫瑰花环，在显微镜下可以观察到吸附有红细胞的B淋巴细胞，以此计算B淋巴细胞的数目。Fc受体并非B细胞所特有，中性粒细胞、单核细胞及巨噬细胞表面均有这种受体，但这些细胞可以通过形态学加以区别。此方法简单，目前较常采用，以检测B淋巴细胞的百分率。 [目的要求]
1. 掌握EA玫瑰花环试验的原理及操作方法。 2. 熟悉淋巴细胞的分离方法。 [材料与试剂]
1. 试管，滴管，吸管，注射器，载玻片，盖玻片，血球计数板，鸡，家兔等。 2. 淋巴细胞分层液，无钙、镁的Hank’s液，肝素液，姬姆萨染色液，1% 戊二醛溶液，95% 乙醇，2%盐酸溶液等。
3. 鸡红细胞悬液的制备：由于绵羊红细胞易于与T淋巴细胞形成E-玫瑰花环，造成混淆，所以一般在检测B淋巴细胞时，采用鸡红细胞。从鸡翅下静脉采血，用肝素抗凝，以Hank’s液洗涤3次，最后配成4% 的细胞悬液。
4. 抗鸡红细胞抗体的制备（溶血素）：参见实验十，溶血素凝集价为1:2000。 [操作方法]
1. 分离淋巴细胞，制成 X 10个/ml细胞悬液。
2. EA悬液的制备：取4% 鸡红细胞悬液2ml加入试管中，再加等量的1:4000 稀释的溶血素，混匀，37℃水浴15min，取出后离心，以Hank’s液洗2次，再以2ml Hank’s液悬浮，即为4%的EA悬液。
3. 取淋巴细胞悬液于试管中，加入等量的4% 的EA悬液，混匀，室温作用30min，1000r/min离心5min，吸弃过多的上清液，置4℃ 2-4h。
4. 取出后，将沉淀轻轻摇起，加1% 戊二醛溶液，混匀后置4℃固定30min。 5. 以悬液制片，自然干燥，滴加姬姆萨染色液染色2min，加自来水继续放置15min，冲洗，将玻片置95% 酒精缸腿色15-30S（以脱成浅紫蓝色为度），再置盐酸液缸（按1% HCl 1份与自来水2份）脱色10S左右（呈淡兰略带红色为度），取出冲洗，干燥镜检。
6. 结果判定：凡1个淋巴细胞结合3个以上鸡红细胞即为EA花环形成阳性细胞，共计数200个淋巴细胞，计算花环形成率。 [注意事项]
6
1. 加入淋巴细胞与鸡红细胞的比例一般以1:40为宜，（1:30-1:50），淋巴细胞过少，花环形成率明显减少。
2. 淋巴细胞、红细胞均应新鲜，否则花环形成率明显下降。 [思考题]
1. EA玫瑰花环试验的原理是什么？ 2. EA玫瑰花环试验的操作方法。
实验七 EAC玫瑰花环试验
B淋巴细胞表面有补体受体，红细胞可与相应的抗体(溶血素)结合形成抗原抗体复合物
(EA)，通过补体经典途径活化补体，而产生活化的C3， C3 与EA及B细胞结合，形成花环，即EAC玫瑰花环，以供计数B淋巴细胞。 [目的要求]
1. 熟悉EAC玫瑰花环试验的原理。 2. 熟悉EAC玫瑰花环试验的操作方法。 [材料与试剂]
1. 基本同EA玫瑰花环试验。
2. 补体：当日采集豚鼠混合血清，用Hank’s液稀释成1:100，置4℃保存备用。 [操作方法]
1. EAC悬液的制备：取4% 鸡红细胞2ml于试管中，加入1:4000稀释的溶血素2ml，混匀，置37℃水浴15min，取出后离心，用Hank’s液洗涤2次，再以2ml Hank’s液稀释沉淀细胞，加1:100稀释的补体2ml，混匀，放置37℃水浴15min取出，用Hank’s液洗涤2次，配成4% EAC细胞悬液。
2. 取淋巴细胞悬液于试管中，加入4% 的EAC悬液，混匀，室温作用30min，1000r/min离心5min，吸弃过多的上清液，置4℃ 2-4h。
3. 固定，制片，染色同EA玫瑰花环试验。 4. 结果判定：同EA玫瑰花环试验。 [注意事项]
1. 同EA花环形成试验。 2. 补体应现用现采集。 [思考题]
1. EAC玫瑰花环试验的原理是什么? 2. 实验中所需补体为什么现用现采集?
实验八 酶联免疫吸附试验
酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbentassay，ELISA）是目前发展最快，应用最广泛的一种免疫学检测技术。其基本过程是将抗原或抗体吸附于固相载体上，在载体
上进行免疫酶染色，底物显色后以肉眼或酶标仪检测结果。通过酶与底物作用呈现颜色的深度，进行定量或定性分析。本试验将抗原抗体反应的特异性与酶的高催化活性相结合，使测定方法达到很高的敏感性，且特异性强，可用于生物活性物质的微量检测及疾病诊断，广泛应用于整个生命科学领域。 [目的要求]
1. 掌握酶联免疫吸附试验的原理及基本操作方法。
2. 了解猪群猪瘟抗体监测的意义及鸡传染性法氏囊病病毒检测的方法。 [材料与试剂]
1. 酶标板，酶联检测仪（酶标仪），微量加样器，滴头（tip头）。
2. 0.01mol/L PBS（）， L PBST（含%土温20）， 2mol/L H2SO4，碳酸盐缓冲液（包被液），封闭液，邻苯二胺（OPD），3% H2O2，柠檬酸盐缓冲液。
3. 猪瘟病毒抗原，兔抗猪IgG酶标抗体，待检血清，猪瘟阳性血清，猪瘟阴性血清。 4. 鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）特异性抗体，IBDV抗原，待检IBDV抗原，酶标抗IBDV的单克隆抗体。 [实验内容与操作方法]
（一）间接ELISA（以猪瘟抗体的检测为例，该法可用于猪瘟抗体监测）
1. 包被：用碳酸盐缓冲液稀释猪瘟病毒抗原至1?g/ml，以微量加样器每孔加样100?L，置湿盒内37℃包被2-3h。
2. 洗涤：以PBST冲洗酶标板，共洗5次，每次3min。
3. 加待检血清：每孔加100?L PBS，然后在酶标板的第1孔加100?L待检血清，以微量加样器反复吹吸几次混匀，吸100?L加至第2孔，依次倍比稀释至第10孔，剩余的100?L弃去，置湿盒内37℃作用2h。
4. 洗涤：同上。
5. 加酶标抗体：以PBS将兔抗猪IgG酶标抗体稀释至工作浓度，每孔加100?L，置湿盒内37℃作用2h。
6. 洗涤：同上。
7. 加底物显色：取10ml柠檬酸盐缓冲液，加OPD 4ml和3% H2O2 100 ?L，每孔加50?L，置湿盒内避光显色10min。
8. 终止反应：每孔加2mol/L H2SO4溶液100?L终止反应。
动物免疫学实验指导
