表1-2 平板凝集试验与试管凝集试验的关系
平 板 凝 集 相当于试管凝集
80?L 1:25
40?L 1:50
20?L 1:100
10?L 1:200
7. 判定标准：同试管凝集试验。
8. 注意：对于阳性及可疑的被检血清需用试管凝集试验进行验证。 （三）虎红平板凝集试验
这种试验是快速平板凝集试验。抗原是布氏杆菌加虎红制成。虎红平板凝集试验可与试管凝集试验及补体结合试验效果相比，具有操作简单、快速、特异性强的优点。
1. 被检血清和布氏杆菌病虎红平板凝集抗原各30?L滴于玻璃板的方格内，每份血清各用一支牙签或火柴棒混合均匀。在室温（20℃）4-10min内记录反应结果。同时以阳、阴性血清作对照。
2. 结果判定：在阳性血清及阴性血清试验结果正确的前提下，被检血清出现任何程度的凝集现象均判为阳性，完全不凝集的判为阴性，无可疑反应。
3. 注意：抗原用前充分摇匀，抗原和被检血清用前应放室温30-60min后再进行试验。 （四）鸡白痢平板凝集试验
1. 被检鸡血清和鸡白痢平板凝集抗原各1滴（约30?L）滴于玻板或载玻片上，用牙签或火柴棒充分混合。
2. 结果判定：在室温（20℃）下，观察30-60s，凝集者为阳性，不凝集者为阴性。
[思考题]
1. 凝集反应的原理是什么? 2. 哪些因素影响细菌凝集试验?
3. 凝集试验中为什么要设阳性、阴性血清及抗原对照？
实验二 沉淀试验
可溶性抗原(如细菌浸出液、含菌病料浸出液、病毒、血清以及其他来源的蛋白质、多糖、类脂等)与其相应的抗体结合后，在电解质参与下，形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀反应(Precipitation reaction)。 沉淀反应中的抗原称为沉淀原（Precipitinogen），抗体称为沉淀素（Precipitin）。
沉淀反应主要包括有环状沉淀试验、琼脂扩散沉淀试验及免疫电泳等。 [目的要求]
1. 掌握炭疽环状沉淀试验的操作方法和结果观察。 2. 掌握琼脂扩散沉淀试验的原理和操作方法。 3. 了解对流免疫电泳的—般原理和操作技术。 [材料与试剂]
1. 口径0.4cm的小试管，毛细滴管，载玻片，平皿，烧杯没，打孔器，针头，酒精灯，加样器（移液器），滴头，电泳槽，电泳仪等。
2. 生理盐水，% NaCl溶液，% 石炭酸生理盐水，巴比妥缓冲液，琼脂粉等。 3. 炭疽沉淀抗原（炭疽标准抗原），炭疽沉淀素血清，待检抗原。
4. 禽流感琼扩抗原，禽流感阳性血清，待检鸡血清；兔抗猪IgG，猪血清，鸡血清，兔血清、牛血清，羊血清等。
5. 小鹅瘟琼扩抗原，小鹅瘟抗血清；鸡传染性法氏囊病琼扩抗原（或待检法氏囊组织浸提液），鸡传染性法氏囊病阳性血清。 [实验内容及操作方法] （一）环状沉淀试验
环状沉淀试验(Ring precipitation test)是最早的沉淀反应。目前在链球菌的分类、鉴定，昆虫吸血性能及所吸血液来自何种动物的鉴别，肉品种属鉴定及炭疽尸体与皮张的检验工作中仍然应用。以炭疽环状沉淀反应为例，此反应又称Ascoli氏反应。
1. 待检抗原的制备
(1) 取疑为炭疽死亡动物的实质脏器1g放入小烧杯中剪碎，加生理盐水5-10ml，煮沸30min，冷却后用滤纸过滤使之呈清澈透明的液体，即为待检抗原。
(2) 如待检材料是皮张、兽毛等，可采用冷浸法。先将样品高压灭菌30min后，皮张剪为小块并称重，加5-10倍的% 石炭酸生理盐水，置室温浸泡10-24h。用滤纸过滤2-3次，
使之呈清朗的液体，此即为待检抗原。
2. 加样：取3支口径0.4cm的小试管，在其底部各加约 ml 的炭疽沉淀素血清(用毛细滴管加，注意液面勿有气泡)。取其1支，用毛细滴管将待检抗原沿着管壁轻轻加入使重叠在炭疽沉淀素血清之上，上下两液间有一整齐的界面，注意勿产生气泡。另2支小试管，一支加炭疽沉淀抗原，另一支加生理盐水，方法同上，作为对照。
3. 结果判定：5-10min内判定结果，上下重叠两液界面上出现乳白色环者，为炭疽阳性。对照组中，加炭疽沉淀抗原者应出现白环，而加生理盐水者应不出现白环。
4. 注意：观察结果时，可将一只手放在小试管对测的适当位置上遮挡光线，有利于看到白色沉淀环。
（二）琼脂扩散沉淀试验
琼脂扩散沉淀试验（Agar gel precipitation test，AGPT）是沉淀反应的一种形式。物质自由运动形成扩散现象，扩散可以在各种介质中进行。1% 琼脂凝胶形成网状构架，空隙中是98%-99% 的水，允许分子量在200ku以下分子通过。绝大多数可溶性抗原和抗体的分子量在200ku以下，因此可以在琼脂凝胶中自由扩散，所受阻力甚小。二者在琼脂凝胶中相遇，在最适比例处结合成复合物，此复合物因颗粒较大而不能扩散，故形成沉淀带。
本试验可用已知抗体检测样品中的抗原，也可用已知抗原检测血清样品中的抗体。 1. 琼脂板制备：称取1g琼脂粉，加入100ml 生理盐水或% NaCl溶液（禽类），煮沸使之溶解。待溶解的琼脂温度降至60℃左右时倒入平皿中，厚度为2-3mm。
2. 打孔：用打孔器在琼脂凝胶板上按7孔梅花图案打孔，孔径约3-5mm，中心孔和周围孔间的距离约为3-5mm。挑出孔内琼脂凝胶，注意不要挑破孔的边缘。
3. 封底：在火焰上缓缓加热，使孔底琼脂凝胶微微融化，以防止孔底边缘渗漏。 4. 加样：以毛细滴管（或加样器）将样品加入孔内，注意不要产生气泡，以加满为度。 （1）血清流行病学调查：将禽流感琼扩抗原置中心孔，周围1、3、5孔加禽流感阳性血清，2、4、6孔分别加待检鸡血清，每加一个样品应换一个滴头。
（2）抗血清效价测定：将猪血清（抗原）加入中心孔，将兔抗猪IgG（抗体）作2倍比稀释，即 l:2、1:4、1:8、l:16、1:32等，分别加至周围孔中。或者是将小鹅瘟琼扩抗原加入中心孔，周围孔加入l:2、1:4、1:8、l:16、1:32等稀释的小鹅瘟抗血清。
（3）抗原检测：将兔抗猪IgG（抗血清）加入中心孔，将待测抗原（猪血清、鸡血清、兔血清、牛血清、羊血清等）置于周围孔中。或者是将鸡传染性法氏囊病阳性血清加入中心
孔，周围孔加鸡传染性法氏囊病琼扩抗原（或待检法氏囊组织浸提液）。
5. 感作：将琼脂凝胶板加盖保湿，置于37℃温箱，24-48h后，判定结果。 6. 结果判定
（1）血清流行病学调查：待检孔与阳性孔出现的沉淀带完全融合者判为阳性。待检血清无沉淀带或所出现的沉淀带与阳性对照的沉淀带完全交叉者判为阴性。
（2）抗血清效价测定：以出现沉淀带的血清最高稀释倍数为抗血清的AGP效价。 （3）抗原检测：兔抗猪IgG与猪血清孔之间有明显沉淀带，与其他血清孔之间不形成沉淀带。鸡传染性法氏囊病阳性血清与鸡传染性法氏囊病琼扩抗原孔之间出现沉淀带，如与待组织浸提液孔之间出现沉淀带，说明该法氏囊组织中有鸡传染性法氏囊病病毒抗原。
（三）对流免疫电泳
在pH值的琼脂凝胶中，抗体球蛋白带有微弱的负电荷，在电泳时，由于电渗作用的影响，抗体球蛋白反而向负极倒退。而一般抗原蛋白质带负电荷，在电泳力的作用下向正极移动。二者在两孔之间相遇，形成肉眼可见的白色沉淀线。
本法由于抗原抗体分子在电场作用下定向运动，限制了自由扩散，从而提高了敏感性，它较琼脂扩散试验敏感性高10-16倍，并可大大缩短沉淀线出现的时间，适用于快速诊断。
1. 琼脂板制备：用巴比妥缓冲液配制1%% 琼脂凝胶板，厚度2-3mm。
2. 打孔：孔径3-5mm，孔距4-10mm，一张载玻片可打12个孔，挑去孔内琼脂，封底。 3. 加样：一对孔中，一孔加已知（或待测）抗原，另一孔加待测（或已知）抗体。 4. 电泳：在电泳槽内加入pH 的巴比妥缓冲液，将滤纸片放入缓冲液内浸湿搭桥。将抗原孔置于负极端。电压cm，或电流强度3-5mA/cm，电泳时间为30-90min 。
5. 结果观察：断电后，将凝胶板置于灯光下，衬以黑色背景观察。阳性者则在抗原与抗体孔之间形成一条清楚致密的白色沉淀线。如沉淀线不清晰，可将琼脂凝胶板放在湿盒中37℃数小时或置电泳槽过夜再观察。 [思考题]
1. 进行环状沉淀试验时，注意事项是什么？ 2. 琼脂扩散沉淀试验的操作方法及其应用。 3. 对流免疫电泳的原理是什么？
实验三 溶血试验
红细胞与其相应的抗体（溶血素）发生特异性结合，当加入补体时，抗原抗体复合物通过经典途径使补体活化，产生膜攻击作用，最后导致红细胞溶解，发生溶血反应。
羊红细胞或鸡细胞 + 免疫血清（溶血素）+ 豚鼠血清（补体） → 溶血反应。 补体（Complement）是存在于正常人和脊椎动物血清及组织液中一组具有酶原活性的蛋白质，以豚鼠血清中的补体成分较全且活性高。由于补体对热敏感，56℃ 30min即被灭活，室温放置很快失活，0-10℃其活性仅能保持3-4d，实验时可以采用新鲜的豚鼠血清。 [目的要求]
1. 通过溶血试验，掌握抗原、抗体与补体的关系及作用特点，理解和验证补体被激活后的溶细胞作用。
2. 掌握溶血试验的操作与观察结果的方法。 [材料与试剂]
1. 试管，试管架，可调加样器，滴头，滴管，注射器，针头等。
2. 灭菌生理盐水，2% 山羊红细胞悬液，兔抗山羊红细胞抗体（溶血素）， 2% 鸡红细胞悬液，兔抗鸡红细胞抗体（溶血素），豚鼠血清。 [实验内容及操作方法]
1. 2% 山羊(或鸡)红细胞悬液的制备：无菌取山羊(或鸡)抗凝血，离心去血浆，沉淀用生理盐水洗涤3次，每次2000r/min，离心10min，然后去掉上清液，血细胞泥用生理盐水配成2% 的红细胞悬液。
2. 溶血素的制备：将免疫血清（溶血素）用生理盐水稀释成2单位（1:500-1:1000），56℃水浴30 min灭活。
3. 补体的制备：将新鲜豚鼠血清（补体）用生理盐水稀释成1:20，取1 ml 置56℃水浴30min灭活。
4. 取小试管5支，依次编号。按表3-1加入各成分，摇匀，置37℃水浴30min。 5. 结果观察：若管底无红细胞沉淀，上层液体红色透明者为完全溶血。若液体呈混浊或放置后管底有红细胞沉淀为不溶血。
表3-1 溶血试验（单位：ml ）
动物免疫学实验指导
