水稻抽穗期QTL DTH2的图位克隆和功能分析

水稻抽穗期 QTL DTH2 的图位克隆和功能

分析# 吴玮勋1，江玲1，钟铮铮2，陆广文1，万建民1**

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（1. 南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，南京 210095；

2. 中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081）

摘要：开花时间（作物中指抽穗期）是决定生长季节和植物适应特定自然环境的地区适应性 的重要生态性状。水稻是起源于热带地区的短日作物。本文鉴定了一个在长日照条件下促进 抽穗的微效数量性状位点 DTH2，并对其进行了分子克隆。互补和 RNA 干扰实验证实 DTH2 编码一个 CONSTANS-like 蛋白。DTH2 蛋白定位在细胞核内并具有转录自激活活性，并且 DTH2 的表达受节律钟调控。我们发现通过诱导成花素基因 Heading Date 3a (Hd3a) 和 RICE FLOWERING LOCUS T 1 (RFT1) 来促进抽穗，并且独立于已知的开花集成子 Heading date 1 (Hd1) 和 Early heading date 1 (Ehd1)，体现了微效 QTLs 在作物育种中起重要作用。 关键词：水稻；DTH2 克隆；抽穗期；功能分析 中图分类号：S511.S330.2+5

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Map-based cloning and function analysis of QTL DTH2 for

heading date in rice (Oryza sativa L.)

WU Weixun1, JIANG ling1, ZHONG Zhengzheng2, LU Guangwen1, WAN Jianmin1

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(1. State Lab of Crop Genetics and Germplasm Ehancement, Nanjing Agricultural University,

NanJing 210095;

2. Cro Science Institute, CAAS, Beijing 100081)

Abstract: Flowering time (heading date in crops) is an important ecological trait that determines growing seasons and regional adaptability of plants to specific natural environments. Rice (Oryza sativa L.) is a short-day plant that originated in the tropics. We report here the molecular cloning and characterization of DTH2, a minor-effect quantitative trait locus (QTL) that promotes heading under long-day conditions (LDs). Complementary test and RNA interference assay confirmed that DTH2 encodes a CONSTANS (CO)-like protein. DTH2 protein is targeted to the nucleus and has transcriptional activation activity and DTH2 expression is regulated by the circadian clock. We show that DTH2 promotes heading by inducing the florigen genes Heading Date 3a (Hd3a) and RICE FLOWERING LOCUS T 1 (RFT1), and it acts independently of the known floral

integrators Heading date 1 (Hd1) and Early heading date 1 (Ehd1), demonstrating an important role of minor-effect QTLs in crop adaptation and breeding.

Keywords: Rice; DTH2 cloning; Heading date; Function analysis

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0 引言

成功的现代农业依赖于作物更好地适应于当地的环境和栽培范围的扩张，主要取决于合 适的开花时间（在水稻中开花时间指抽穗）[1]。光周期敏感性使营养生长和生殖生长适应当 地的气候被认为是使作物适应特异的生态条件和环境变异从而决定开花时间的最重要的因 40

子[1,2]。在合适的生长条件下，延迟抽穗使作物拥有更长的营养生长期，从而促进更多资源 的积累和分配至种子生产，然而短的或不可预知的生长季节则对生育期短的物种有利[3]。资 源分配和压力避免之间的权衡对于作物的产量和质量是特别重要的[3]。

利用拟南芥（长日照植物）和水稻（短日照植物），开花时间的分子机制已经进行了深

基金项目：教育部博士点基金（20090097110011）

作者简介：吴玮勋，（1985-），男，博士研究生，水稻分子遗传学。

通信联系人：万建民，（1960-），男，教授，水稻遗传育种。E-mail: wanjm@njau.edu.cn

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入的研究。在对拟南芥的开花相关研究发现有四种主要途径参与开花调控，分别是光周期途 径，春化途径，自主开花途径和赤霉素途径[4]，其中最重要的是光周期途径。在拟南芥中， GIGANTEA (GI) – CONSTANS (CO) – FLOWERING LOCUS T (FT)是一条主要的长日照促进 开花通路[5-10]，这些基因在水稻中分别有相应的同源基因，组成水稻中的促进开花的通路为 OsGI–Hd1–Hd3a[11-15]。与拟南芥不同，该通路在水稻中仅在短日照下促进开花，因为在长 日照条件下，Hd1 抑制 Hd3a 的表达，导致开花延迟[14]。 50

目前的研究表明水稻的抽穗由 Hd3a（水稻短日照下的主要成花素）和 RFT1（Hd3a 的 同源基因，水稻长日照下的主要成花素）促进[16,17]。在这些成花素基因的上游基因中，Hd1 和 Ehd1 作为两个主要的开花信号集成者，接受来自其它基因的多种信号，如 OsGI, RID1, Ehd3, OsMADS50, OsMADS51, Ghd7, 和 DTH8，来调控成花素基因的表达[2,12,14,18-27]。这些开 花时间基因的克隆为进一步深入了解水稻的开花途径具有重要的借鉴意义。 55

在本研究中，我们克隆了一个微效 QTL，DTH2，在 LD 下诱导开花而在 SD 下没有效 应，研究发现该基因对于促进水稻在长日照下开花起重要作用。

1 材料与方法

1.1 水稻材料和生长条件

以 Asominori（Aso，粳稻）为背景亲本和 IR24（籼稻）为供体亲本的染色体片段置换

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系 CSSL23，携带有来源于 IR24 的 DTH2 基因。为了进一步减少 CSSL23 中的来自 IR24 的 插入片段，我们筛选出了一个以 Aso 为背景，包含 DTH2 位点的 9.6-cM（厘摩）来自 IR24 片段的 nearly isogenic line (NIL)。该 IR24 片段限定于第二染色体 SSR 标记 RM318 和 RM240 之间。Aso 和 NIL 种植在北京自然长日照条件(Natural long-day conditions, NLDs, 116.4° E, 39.9 ° N, day length > 15 h), 海南自然短日照条件(Natural short-day conditions, NSDs, 110.0° 65

E, 18.5° N, day length < 12 h), 光照培养箱控制的短日照条件（Controlled short-day conditions, CSDs, 10h 光, 30°C/14h 暗, 25°C），光照培养箱控制的长日照条件（Controlled long-day conditions, CLDs, 14h 光, 30°C/10h 暗, 25°C）。光照培养箱用荧光灯照明（300μmol m-2 s-1）， 湿度为 70%。

1.2 种子成熟度统计

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在 NLDs 和 NSDs 条件下，Aso 抽穗后 60 天后，取 Aso 和 NIL 的穗子脱粒后根据种皮 的颜色来判断种子的成熟度。即统计黄色糙米在所有糙米中的比例，统计两个穗子，取平均 值作为该单株的成熟度。

1.3 载体构建和植物转化

根据预测的候选基因序列，以 Aso 序列为模板，设计引物，扩增 DTH2 全基因组（引

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物见附表 1）获得了一个 7867bp 的 DNA 片段，该片段包括 4049bp 的上游启动子序列，全 长编码区，1543bp 下游序列。使用日本 Takara 公司的 In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kits（http://bioinfo.clontech.com/infusion/）把该片段同源重组至 pCAMBIA1305.1 的 Sma I 位点，构建 pDTH2-a::DTH2-a 质粒。pDTH2-a::DTH2-a 质粒的翻译起始位点处正好有一个 Nco I 酶切位点，1305 质粒的 GUS 基因翻译起始位点处也有一个 Nco I 酶切位点，因此用 80

Nco I 酶切 pDTH2-a::DTH2-a 质粒移除 DTH2 的编码区和 CaMV 35S 启动子，之后用 T4 DNA 连接酶使载体自连以形成 pDTH2-a::GUS 载体。通过引物（附表 1）使用 Warthmann 等[28]

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片段重组至 pCAMBIA2300 的 XmaⅠ位点来构建 RNAi 载体。

报道的方法扩增一段包含 DTH2 人工 miRNA 序列的 261bp 片段，通过同源重组的方法把该

通过电转的方法将上述构建的双元载体转化入农杆菌菌株 EHA105，然后通过农杆菌介

85 导的方法进行水稻遗传转化。把 pDTH2-a::GUS 载体，干扰载体和干扰空载体转化入 Aso 的 愈伤中，把全长互补载体和全长互补空载体转入 NIL 的愈伤中。

阳性的 pDTH2-a::GUS 转基因植株筛选后进行 GUS 染色[29]，用体视镜(Leica DFC420) 拍照。

1.4 亚细胞定位和转录自激活活性分析

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首先用引物（附表 1）扩增没有终止密码子的 DTH2-a CDS 片段，然后通过同源重组的 方法把该片段重组至 pAN580 的 Bam HI位点。使用 PEG 介导的方法将 DTH2-a-GFP 融合蛋 白和核 marker OsMADS3-mCherry 共定位于水稻叶片原生质体中[30,31]。GFP 检测用激光共聚 焦显微镜（Leica TCS-SP4）进行观察。转录自激活实验用 Matchmaker GAL4 Two-Hybrid System 3 (Clontech)进行。首先用引物（附表 1）扩增 DTH2-a CDS 和各种缺失片段，然后通 95

过同源重组的方法把该片段重组至 pGBKT7 的 Eco RI位点，并使各片段分别与 GAL4 DNA 结合结构域完全融合，最终构建如下 5 个载体：BD-DTH2-a，BD-ΔZF，BD-ΔMR，BD-ΔCCT 和 BD-ΔZF/CCT。所有 5 个载体和空载体都转化入酵母菌株 AH109。转录自激活活性分析 使用 Clontech 公司的 Matchmaker GAL4 Two-Hybrid System 3 进行。β-半乳糖活性的测定根

据 Clontech 的 操 作 手 册 进 行 ( 略 有 修 改 ) ， 用 液 体 培 养 的 方 法 ， 使 用 chlorophenol

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red-β-D-galactopyranoside (CPRG; Roche Biochemicals) 作为反应底物。

1.5 节律表达材料的种植与取样

为了研究 DTH2 在 Aso 和 NIL 中的节律表达情况，在光照培养箱控制的长日照条件 （Controlled long-day conditions, CLDs, 14h 光, 30°C/10h 暗, 25°C）和光照培养箱控制的短日 照条件（Controlled short-day conditions, CSDs, 10h 光, 30°C/14h 暗, 25°C）下都种植 Aso 和 NIL，每种条件下种植 3 盆。每盆分两半，使每盆都有 Aso 和 NIL，保证种植条件一致。在 CLDs 下 68 天，CSDs 下 36 的时候，开始取样，每四小时取一次样，取水稻植株的次新叶， 每次取三株，取完后迅速装袋然后放入液氮中速冻使材料保持新鲜，一共取 48h。用第一天 取 的 材 料 来 研 究 其 它 基 因 如 Hd3a, RFT1, Hd1, Ehd1, OsMADS14, OsMADS15, RID1/OsId1/Ehd2, Ehd3, OsMADS50, OsMADS51, Ghd7 和 DTH8 在 Aso 和 NIL 中的表达情 况。各种用于节律表达分析的开花时间 NILs，或野生型和相应的突变体材料包括 Hd1 的 NILs，Ehd1 的 NILs，Tohoku IL9/ehd2 突变体，Tohoku IL9/ehd3 突变体，Dongjin/osmads50 突变体，Dongjin/osmads51 突变体，Ghd7 的 NILs 和 DTH8 的 NILs 种植在 CLDs。在第 49 天的暗期后 2h 取样，分别收集 3 株苗的次新叶。RNA 提取使用 QIAGEN 公司的 RNeasy Plant Mini Kit，略有修改。RT-PCR 用 QIAGEN 公司的 QuantiTect? Reverse Transcription Kit，略 有修改。Quantitative RT-PCR 用 TaKaRa 的 SYBR? Premix Ex TaqTM Kit，20μl 反应体系。 在 Applied Biosystems 的 ABI PRISM 7900HT Real-time PCR 仪上进行反应。水稻 UBQ 基因 (LOC_Os03g13170)作为内参。Quantitative RT-PCR 的引物序列见附表 1，数据用相对定量的 方法进行统计[32]。

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