广西巴马小型猪ApoA1基因克隆及其<p>生物信息学分析</p><p><br/></p>

南方农业学报JournalofSouthernAgriculture2024，50（6）：1339-13466期2095-1191；ISSNCODENNNXAABhttp://www.nfnyxb.com·1339·DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2024.06.25广西巴马小型猪ApoA1基因克隆及其

生物信息学分析

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张名媛1，，韦东力2，司景磊2，郭晓萍1，，崔悦悦2，瞿秋红2，綦文晶2，

兰干球2，郭亚芬2*

（1广西医科大学实验动物中心，南宁530021；2广西大学动物科学技术学院，南宁530004）

摘要：【目的】克隆广西巴马小型猪载脂蛋白A1（ApoA1）基因并进行生物信息学分析，为后续开展ApoA1基因研究提供基础数据，同时为制作广西巴马小型猪动脉粥样硬化疾病模型打下基础。【方法】以提取的广西巴马小型猪肝脏组织总RNA为模板，运用RT-PCR克隆广西巴马小型猪ApoA1基因序列，以实时荧光定量PCR（qPCR）检测ApoA1基因在广西巴马小型猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织中的表达情况，并利用MegAlign、ProtParam、SOPMA、Net-Phos、SignalP和SWISS-MODEL等在线分析软件对广西巴马小型猪ApoA1基因进行生物信息学分析及构建系统发育进化树。【结果】广西巴马小型猪ApoA1基因编码区（CDS）序列长795bp，与普通猪ApoA1基因序列的同源性为99.9%，仅第630处有1个碱基发生同义突变。ApoA1基因在广西巴马小型猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织中均有表达，且以肝脏中的相对表达量最高、脾脏中的相对表达量最低。广西巴马小型猪ApoA1由264个氨基酸残基构成，其分子式为C1343H2136N376O409S5，蛋白分子量为30254.31Da，理论等电点（pI）为5.47，属于亲水性蛋白，存在跨膜结构，不存在信号肽，有18处磷酸化位点（丝氨酸磷酸化位点有10处，苏氨酸磷酸化位点有6处，络氨酸磷酸化位点有2处）。广西巴马小型猪ApoA1的二级结构中，α-螺旋占79.92%，β-折叠占2.65%，无规则卷曲占11.12%，延伸链占6.31%，属于全α类蛋白。广西巴马小型猪ApoA1氨基酸序列与普通猪的同源性最高，达99.6%；由基于ApoA1氨基酸序列同源性构建的系统发育进化树也可看出，广西巴马小型猪与普通猪的亲缘关系最近。【结论】广西巴马小型猪ApoA1基因保守性强，以在肝脏中的表达量最高，是广西巴马小型猪抗动脉粥样硬化的重要因子，通过敲除该基因可制作广西巴马小型猪动脉粥样硬化疾病模型。

关键词：广西巴马小型猪；ApoA1基因；克隆；生物信息学分析；动物模型中图分类号：S828.89文献标志码：A文章编号：2095-1191（2024）06-1339-08

CloningandbioinformaticsanalysisofApoA1geneinGuangxi

Bamamini-pig

22

ZHANGMing-yuan1，，WEIDong-li2，SIJing-lei2，GUOXiao-ping1，，CUIYue-yue2，

QUQiu-hong2，QIWen-jing2，LANGan-qiu2，GUOYa-fen2*

2

（1LaboratoryAnimalCenter，GuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，China；CollegeofAnimalScienceand

Technology，GuangxiUniversity，Nanning530004，China）

Abstract：【Objective】TheaimofthisstudywastoclonetheapoliproteinA1（ApoA1）geneofGuangxiBamamini-pig，andanalyzethebiologicalinformationofApoA1gene，whichwouldenrichthebasicdataforthefollow-upstudyof

ApoA1geneandlayafoundationfortheproductionoftheatherosclerosisdiseasemodelofGuangxiBamamini-pig.【Method】TotalRNAextractedfromtheheartandliverofGuangxiBamamini-pigwasastemplate，andthesequenceofApoA1genewasclonedbyRT-PCR.TheexpressionofApoA1geneinheart，liver，spleen，lungandkidneyofGuangxiBamamini-pigwasdetectedbyreal-timefluorescencequantitative（qPCR）.OnlineanalysissoftwaresincludingMegA-lign，ProtParam，SOPMA，NetPhos，SignalPandSWISS-MODELwereusedtoanalyzethebioinformaticsofApoA1geneandconstructphylogenetictree.【Result】Thelengthofcodingsequence（CDS）regionofApoA1geneofGuangxiBamamini-pigwas795bpandthehomologywas99.9%comparedwiththeApoA1genesequenceofpigswithasynony-mymutationononebaseatthe630position.TheApoA1genewasexpressedinheart，liver，spleen，lungandkidneyofGuangxiBamamini-pigwiththehighestexpressioninliverandthelowestexpressioninspleen.ThemolecularformulaofApoA1geneencoding264aminoacidresiduesinGuangxiBamamini-pigwasC1343H2136N376O409S5，themolecularweightwas30254.31Da，andthetheoreticalpIwas5.47，belongingtohydrophilicprotein.Therewastransmembranestructure，nosignalpeptide.Therewere18phosphorylationsites，including10sitesofserine，6sitesofthreonineand2sitesof收稿日期：2024-04-19基金项目：国家重点研发计划项目（2017YFD0501600）；广西青年科学基金项目（2024GXNSFBA281066）作者简介：*为通讯作者，郭亚芬（1957-），教授，主要从事动物遗传育种与繁殖研究工作，E-mail：guoyafen@163.com。张名媛

（1986-），博士，主要从事动物遗传育种与繁殖研究工作，E-mail：Bio_MYZhang@163.com

·1340·南方农业学报50卷tyrosine.Thesecondarystructureofcodingproteinbelongedtoall-alphaprotein，whichconsistedofα-helix，β-fold，ran-domcoilandextendedstrand，accountingfor79.92%，2.65%，11.12%and6.31%，respectively.Itwasfoundthattheho-mologyofApoA1aminoacidsequencebetweenGuangxiBamamini-pigandordinarypigwasthehighest（99.6%）.Ac-cordingtophylogenetictreebasedonApoA1aminoacidsequencehomology，GuangxiBamamini-pighadtheclosestge-neticrelationshipwithpig.【Conclusion】ThesequenceofApoA1geneinGuangxiBamamini-pigisstronglyconservative

andexpressesthehighestinliver.Itisanimportantfactorofanti-atherosclerosisinGuangxiBamamini-pig.ThemodelofatheroscleroticdiseaseinGuangxiBamamini-pigcanbeproducedbyknockingouttheApoA1gene.

Keywords：GuangxiBamamini-pig；ApoA1gene；cloning；bioinformaticsanalysis；animalmodel

0引言

【研究意义】动脉粥样硬化是心脑血管疾病中

非常严重的一种疾病，但其致病机理尚未完全明确东和严激，2010）。载脂蛋白A1（ApoliproteinA1，ApoA1）是高密度脂蛋白（Highdensitylipopro-tein，HDL）的主要组成部分，能激活卵磷脂胆固醇脂酰转移酶（Lecithin-cholesterolacyltransferase，LCAT），参与胆固醇的逆转运，是重要的抗动脉粥样硬化因子（田迪，2013；汤磊乐等，2017），即ApoA1特异性自身抗体在心血管疾病中具有重要价值（Chis-tiakovetal.，2016）。因此，研究广西巴马小型猪ApoA1基因及其调控机理，可进一步丰富ApoA1基因的基础数据，并为制作广西巴马小型猪动脉粥样硬化疾病模型打下基础。【前人研究进展】血浆中脂蛋白的蛋白部分称为载脂蛋白，ApoA1是载脂蛋白的一种，占蛋白总量的60%~70%（Heinecke，2013；刘培彬等，2014）。ApoA1主要存在于血浆中，其密度为1.063~1.210g/mL（雷蕾和陈丽，2011），缺乏ApoA1会导致低HDL血症。有研究证实，ApoA1水平与冠脉病变呈负相关，可能具有延缓冠脉病变进展的作用，因此可用于预测冠脉病变进展风险（汤磊乐等，2017），其反义转录本（ApoliproteinA1Antisensetranscript，ApoA1-AS）是诊断冠状动脉疾病的新生物标志物（Zhangetal.，2024）。目前，已有研究报道了人类、黄鳝和鹅的ApoA1基因序列及其在各物种间的核苷酸序列结构差异（麻延峰等，2015；阚延泽等，2016）。关于ApoA1基因的表达，张旭等（2011）研究表明，ApoA1转基因小鼠的血液、肾脏、脾脏、肝脏、心脏和血管等组织中均有ApoA1基因表达；阚延泽等（2016）、赵佳福等（2024）研究证实，ApoA1基因在黄鳝和从江香猪的肝脏中表达量最高。在生产性状的关联性研究中，已有学者分析了ApoA1基因多态性与兔、鸡和鹅生产性状间的关联性，并验证其作为分子育种候选基因的可行性，即可开发成一种辅助选择遗传标记（万洁，2008；熊婷，2012；麻延峰等，2015）。张晶（2012）在筛选分析与猪脂肪沉积相关的关键基因时也发现有ApoA1基因；赵佳福等2017）对从江香猪ApoA1基因进行亚细胞定位，发

现ApoA1基因的表达主要集中在细胞外基质中，该

结论为人类因肥胖引起相关疾病的研究奠定了基础。【本研究切入点】广西巴马小型猪是在巴马香猪的基础上培育出的实验动物品系，具有体型矮小、遗传相似性高、与人类相近且遗传稳定性强等特点，是作为实验动物模型的理想材料（李芳芳等，2014；李龙等，2017；Wuetal.，2024；Yanetal.，2024），且诸多基因信息已被深入发掘（吴丹等，2013；宋少锐等，2014；申玉建等，2017；张广杰等，2024），但至今未见广西巴马小型猪ApoA1基因克隆及序列分析的相关文献报道。【拟解决的关键问题】从广西巴马小型猪肝脏中克隆出ApoA1基因，并应用在线生物信息软件对其进行分析学分析，为后续开展ApoA1基因研究提供基础数据，同时为制作广西巴马小型猪动脉粥样硬化疾病模型打下基础。

1材料与方法

1.1

试验材料

从广西大学广西巴马小型猪繁育中心采集广西巴马小型猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏等组织样品，迅速移到液氮中速冻后置于-80℃冰箱保存备用。TaqDNA聚合酶购自南京诺唯赞生物科技有限公司；Biospin胶回收试剂盒购自杭州博日科技有限公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；琼脂糖（Agrose）购自Biowest公司；胰蛋白胨和酵母浸出物购自德国OXIDO公司；氯化钠、异丙醇和无水乙醇购自天津市永大化学试剂有限公司；氨苄青霉素购自北京天根生化科技北京）有限公司；乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）购自山东博盛生物科技有限公司；TRIzol试剂、反转录试剂盒和SYBR?PremixExTaqTMII购自TaKaRa公司。1.2引物设计与合成

通过GenBank检索从NCBI已公布的猪基因序列中寻找ApoA1基因序列（登录号NP_999563.1），经比对分析最终获得广西巴马小型猪ApoA1相关基因片段，使用Oligo6.22设计可用于ApoA1基因克隆及进行实时荧光定量PCR（qPCR）分析的特异引物，委托北京六合华大基因科技有限公司合成，引物序列信息详见表1。（陈（（6期张名媛等：广西巴马小型猪ApoA1基因克隆及其生物信息学分析

·1341·表1引物序列

Table1Primerssequenceusedinthisstudy

引物名称PrimerApoA1-FApoA1-RApoA1-F1ApoA1-R1

引物序列Primersequence5'-ATGAAAGCCGTGGTGC-3'5'-TCACTGGGCGTTCAGCTTC-3'5'-CCTCCGCTTTGGGAAAACACCT-3'5'-AGCGCCTCGGTCTCCTTTTCCAG-3'

扩增片段大小（bp）Amplifiedfragmentsize

795

142

1.3

RNA提取

采用TRIzol法提取广西巴马小型猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织的总RNA，以核酸仪检测RNA的浓度和纯度，并用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。1.4cDNA合成

以广西巴马小型猪肝脏组织总RNA为模板，参照TransScriptFirst-StrandcDNASynthesisSupermix反转录说明合成cDNA，用于后续基因克隆。1.5目的基因片段扩增与验证

以广西巴马小型猪肝脏组织cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系20.0μL：cDNA模板2.0μL，ApoA1-F/ApoA1-R引物（10μmol/L）各1.0μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）10.0μL，ddH2O6.0μL。扩增程序：95℃预变性5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，进行34个循环；72℃延伸5min。PCR产物采用1.0%琼脂糖凝胶电泳进行检测，切胶回收后克隆至pMD18-T载体，然后转化DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆进行菌液PCR验证并送至深圳华大基因股份有限公司测序。1.6qPCR检测分析

以广西巴马小型猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织RNA为模板，参照PrimeScriptRTReagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime）试剂盒说明进行qPCR检测，分析广西巴马小型猪ApoA1基因在各脏器组织中的表达情况。1.7生物信息学分析

利用MegAlign、ProtParam、SOPMA、NetPhos、SignalP、SWISS-MODEL等在线分析软件对广西巴马小型猪ApoA1基因及其编码蛋白的理化性质、蛋白磷酸化位点、前体蛋白信号肽、结构域、二级及三级结构等进行预测分析，并基于ApoA1氨基酸序列同源性构建系统发育进化树。

2结果与分析

2.1广西巴马小型猪ApoA1基因克隆及序列分析结果

以广西巴马小型猪肝脏组织cDNA为模板、ApoA1-F和ApoA1-R为引物进行PCR扩增，扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，发现在800bp附近

有一条单一、明亮的条带（图1），与预期结果相符。利用MegAlign对扩增获得的广西巴马小型猪ApoA1基因与普通猪相应基因序列（登录号NP-999563.1）进行比对分析，结果发现广西巴马小型猪ApoA1基因编码区（CDS）序列长795bp，与普通猪ApoA1基因序列的同源性为99.9%。相对于普通猪，广西巴马小型猪ApoA1基因序列第630处的碱基发生突变（图2），导致密码子CTA突变为CTG。由于密码子具有简并性的特点，广西巴马小型猪ApoA1氨基酸序列与普通猪相比并未发生改变，即该基因突变属于同义突变。

M

1

2

800bp700bp

795bp

图1广西巴马小型猪ApoA1基因扩增电泳结果

Fig.1ElectrophoresisresultsofamplifiedproductofApoA1

geneofGuangxiBamamini-pig

2.2广西巴马小型猪ApoA1基因在各脏器组织中

的表达情况

采用qPCR对广西巴马小型猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏组织中的ApoA1基因表达情况进行检测，结果发现ApoA1基因在广西巴马小型猪各主要脏器组织中均有表达，且以肝脏中的相对表达量最高、脾脏中的相对表达量最低（图3），二者差异显著（P<0.05）。

2.3广西巴马小型猪ApoA1基因编码蛋白的理化性质预测结果

经ProtParam在线预测分析得知广西巴马小型猪ApoA1由264个氨基酸残基构成，其分子式为C1343H2136N376O409S5，蛋白分子量为30254.31Da，理论等电点（pI）为5.47，表明该蛋白为酸性蛋白，GRAVY为-0.666。采用ProtScale对ApoA1进行亲/疏水性预测分析，结果（图4）表明广西巴马小型猪ApoA1属于亲水性蛋白；以TMHMM对ApoA1进行前体蛋白跨