一：提蛋白：
1. PBS洗2遍，加RIPA 80-100ul（含10xcooktail）。 2. 在冰上刮到离心管中，在冰上裂解20-30min。 3. 4度离心，13000rpm、10-15min（准备新的离心管、配BCA 200ul/每孔(A:B=50：1)、96孔板加PBS(2个对照组20ul，
实验组18ul)）。
4. 取上清转移到新离心管中，记住转移的体积。 5. 96孔板中每孔加2ul蛋白液。 6. 每孔加200ulA/B混合液。 7. 37度半小时。
8. 测浓度以及标化用一起 在libo文件夹找模板，最后得到每组需要加的RIPA以及loding buffer，还有标化后的浓度。
562波长 0.046斜率 （实验组值-对照组值）/斜率=浓度 浓度最好在4-8ug/ul最好，跑胶时就可以只加10ul蛋白液（蛋白含量40-80ug）
9. 加好对应的RIPA以及loding buffer后，煮蛋白5-15min，-20度保存。 二：跑胶
1. 1.0玻板，洗干净
2. 配制10%或者12%分离胶 一块胶需要5ml 3. 灌分离胶，在分离胶上层灌无水乙醇 4. 配制5%浓缩胶 2块胶需要4ml 5. 待分离胶干后，灌浓缩胶，插梳子
6. 待胶干后，将胶及玻板一起放入电泳槽，拔梳子，倒入1*running buffer（上腔灌满，下腔过电线丝） 7. 预电泳，100v，10-15min
8. 加样（蛋白样品及marker）10ul，marker 5ul 9. 60v 10-20min，之后100-110v 三：转膜
1. 配transfer buffer ，用10*transfer buffer 稀释10倍，并加20%甲醇 2. transfer buffer浸泡海绵、滤纸
3. pvdf膜，甲醇泡1分钟，清水洗2次，泡在transfer buffer里20min 4. 胶取出，在transfer buffer里泡10min 5. 黑胶白膜（一层海绵，2层滤纸）
6. 转膜100v，1—1.5h（黑对黑，冰板，在冰里跑） 四：封闭、一抗、二抗
1．5%脱脂奶粉（pbst溶）1h 37度 2.一抗4度12h
3.pbst洗膜，3次，每次10min 4.二抗（1:5000）1h 37度
5. pbst洗膜，3次，每次10min 6.显影剂A和B各300ul
PBST：1000ml’PBS+1mltween
5%脱脂奶粉：100mlPBST+5g脱脂奶粉
10*running buffer：tris 30.3g 甘氨酸 144.1g sds 10g 加水至1000ml 10*transfer buffer：tris 30.3g 甘氨酸 144.1g 加水至1000ml
1* transfer buffer：100ml10*transfer buffer 200ml甲醇 加水至1000ml
western blot 全过程 详细步骤
