免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结
1、方法操作不难，最大得难处就是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理,每一步知道为什么这样做,这样您才敢大胆地改革先前得不对得方法步骤。如抗体孵育条件主要就是抗体浓度、温度、时间,这三者一般就是相互成反比得（相对)，其中浓度就是最重要得先决条件,温度决定反应得速度、时间决定反应得量。就拿温度来说,可以有4度、室温、37度,我推荐4度最佳,反应最温与,背景较浅；而3７度反应速度较快，时间较短;室温我不太提倡,除非您每次都把环境温度控制在一定得范围,否则,尽量选择前两者。 ２、免疫组化最大得优势就是定位与定性。相比于其她蛋白检测方法,免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，就是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子得转位研究十分有用。
3、免疫组化结果定量分析得前提就是高质量得染色切片.免疫组化结果也能定量分析,但必须就是背景染色浅而特异性染色较深得情况下，分析最为准确,这种原则可能也就是我们日常审稿时判定研究结果得必备条件。
４、免疫组化实验一定要设置阳性对照与阴性对照。阳性对照一般就是用肯定表达这种抗原得切片来做；阴性对照一般就是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者就是排除方法与实验系统有无问题;后者就是排除有无一抗外得非特异性染色。 ５、免疫组化得应用广泛,就是当前实验研究得最重要方法之一。如今发ＳCI论文时,明显感觉仅靠量化得数据来发文章很难,加一些形态学数据或图片,老外十分欢迎，可能就是怕您学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。
6、免疫组化技术掌握与否得鉴定标准就是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良得染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟得反应条件、浓度、方法步骤,重复运用于同一性质得切片与同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法,更换一种抗体后,居然连二抗得种属来源都拿错了。失败往往促进您去思考试验原理与过程，成功有时也加快您自傲。
7、实验方法需要动手+动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那,这就是因为我经过了反复得动手+动脑,把理论原理运用于实践，在把实践中发现得问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通. ?一、概念与常用方法介绍 1 ?、定义用标记得特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分得分布与含量进行组织与细胞原位定性、定位或定量研究,这种技术称为免疫组织化学(ｉmmuｎohistochemiｓtry）技术或免疫细胞化学（imｍunoｃyｔoｃｈemｉstrｙ）技术。 2、原理根据抗原抗体反应与化学显色原理，组织切片或细胞标本中得抗原先与一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等得二抗进行反应,前者再用标记辣根过氧化物酶(ＨRＰ)或碱性磷酸酶(AＫP）等得抗生物素（如链霉亲与素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰瞧见细胞内发生得抗原抗体反应产物,从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分得分布与含量.
3、分类 1)按标记物质得种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶与碱性磷酸酶)、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法与免疫金银法等。 2)按染色步骤可分为直接法（又称一步法)与间接法(二步、三步或多步法)。与直接法相比,间接法得灵敏度提高了许多。３）按结合方式可分为抗原—抗体结合,如过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP)法；亲与连接，如卵白素—生物素—过氧化物酶复合物(ＡBC)法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(SP)法等，其中ＳＰ法就是比较常用得方法;聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高得组织抗原检测。
4、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法就是最早建立得免疫组织化学技术.它利用抗原抗体特异性结合得原理,先将已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或组织内得相应抗原，在荧光显微镜下观察.当抗原抗体复合物中得荧光素受激发光得照射后即会发出一定波长得荧光，从而可确定组织中某种抗原得定位,进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便,所以在临床病理诊断、检验中应用较广。
2）免疫酶标方法免疫酶标方法就是继免疫荧光后,于60年代发展起来得技术。基本原理就是先以酶标记得抗体与组织或细胞作用,然后加入酶得底物,生成有色得不溶性产物或具有一定电子密度得颗粒,通过光镜或电镜,对细胞表面与细胞内得各种抗原成分进行定位研究．免疫酶标技术就是目前最常用得技术。本方法与免疫荧光技术相比得主要优点就是:定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。免疫酶标方法得发展非常迅速,已经衍生出了多种标记方法,且随着方法得不断改进与创新,其特异性与灵敏度都在不断提高，使用也越来越方便。目前在病理诊断中广为使用得有ABC法、ＳP三步法、即用型二步法检测系统等。
3)免疫胶体金技术免疫胶体金技术就是以胶体金这样一种特殊得金属颗粒作为标记物。胶体金就是指金得水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白得生物学活性则没有明显得影响.因此，用胶体金标记一抗、二抗或其她能特异性结合免疫球蛋白得分子(如葡萄球菌A蛋白)等作为探针,就能对组织或细胞内得抗原进行定性、定位,甚至定量研究.由于胶体金有不同大小得颗粒，且胶体金得电子密度高,所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜得单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色,因此也适合进行光镜观察。如应用银加强得免疫金银法则更便于光镜观察。
5、被检测得物质 组织或细胞中凡就是能作为抗原或半抗原,如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激 素、核酸及病原体等都可用相应得特异性抗体进行检测． 6、特点 1）特异性强。免疫学得基本原理决定抗原与抗体之间得结合具有高度特异性,因此,免疫组化从理论上讲也就是组织细胞中抗原得特定显示，如角蛋白（ｋerａtiｎ）显示上皮成分，ＬCA显示淋巴细胞成分．只有当组织细胞中存在交叉抗原时,才会出现交叉反应。2)敏感性高。在应用免疫组化得起始阶段,由于技术上得限制,只有直接法、间接法等敏感性不高得技术,那时得抗体只能稀释几倍、几十倍;现在由于AＢＣ法或SP三步法得出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性得抗体抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。3)定位准确、形态与功能相结合。该技术通过抗原抗体反应及呈色反应,可在组织与细胞中进行抗原得准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合得研究，对病理学领域开展深入研究就是十分有意义得.
7、从蛋白水平检测角度,免疫组化技术与Ｗestern bｌoｔtinｇ、ELＩSＡ得异同
1）Ｗｅsｔｅrn ｂlotting：蛋白质免疫印迹,也就是利用抗体抗原反应原理,结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品内蛋白含量得检测方法.与免疫组化技术相比,定量可能更加准确;当然Weｓtｅｒn bｌotｔing也可定性与定位（通过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白分别检测其中抗原含量,进而间接反映它们得定位),但敏感性远远低于免疫组化技术.2）ELＩSA：酶联免疫吸附试验,也就是利用抗体-抗原-抗原结合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量得检测。与免疫组化技术相比,定量最准确，就是分泌性蛋白检测首选方法之一。
二、实验流程简介 1 ?、ＳP三步法 1）石蜡切片,常规脱蜡至水。2）0、3%或3％H2Ｏ２去离子水（无色液体)孵育１０-3０分钟,以灭活内源性过氧化物
酶活性。３）蒸馏水冲洗,PＢS浸泡5分钟4)候选步骤:采用抗原修复:微波(建议
30分钟内4次中火）、高压、酶修复方法。自然冷却,再用3分钟×3次、 5)血清封闭：室温１5-30分钟，尽可能与二抗来源一致。倾去,勿洗。 6)滴加适当比例稀释得一抗,37℃孵育2~３小时或4℃过夜(最好复温)。PＢＳ冲洗，3分钟×５次。7)滴加生物素标记得二抗，室温或37℃孵育３０分钟-1h。８)PＢS冲洗，3分钟×5次．9）滴加ＳP(链霉亲与素—过氧化物酶），室温或3７℃孵育30分钟-１h。1０）PＢS冲洗,3分钟×5次。11)显色剂显色(DＡB等）.12)自来水充分冲洗.１３）可进行复染，脱水,透明。１4)选择适当得封片剂封片。
2、即用型二步法 １)脱蜡、水化组织切片。２)根据所应用得一抗得特殊要求,对组织切片进行预处理。3)０、3％或3％H２O2去离子水孵育5分钟—３0分钟,以阻断内源性过氧化物酶,PＢS或TBＳ冲洗。4)滴加一抗,室温或37℃孵育30~６０分钟,或4℃过夜,PBS或ＴＢS浸洗３分钟×5次。５)滴加eｎｈangceｒ增强剂,３7度30mｉn,PBS或TBS浸洗3分钟×５次.6）滴加通用型IgG抗体－Ｆab段-HＲＰ多聚体，室温/3７℃孵育30分钟－1h，PBS/TBＳ冲洗,3分钟×5次。７)应用DＡB溶液显色.8）蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片.
三、免疫荧光技术 1 ?、免疫荧光方法中得重要环节 1）冰冻切片制备:建议用新鲜组织,否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散.选用干净锋利得刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂片与脱片严重。2）组织切片固定：切好片风干后立即用冰西奈山环保组织固定液固定5-10min，尤其要较长时间保存得白片，一定要及时固定与适当保存。３）血清封闭:为防止内源性非特异性蛋白抗原得结合，需要在一抗孵育前先用血清(与二抗来源一致)封闭,减弱背景着色。血清封闭得时间就是可以调整得,一般１0—30ｍin。4）一抗孵育条件：在免疫组化反应中最重要,包括孵育时间与抗体浓度。一抗孵育温度有几种:4度、室温、3７度,其中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度１—2h，而４度过夜与从冰箱拿出后37度复温４5miｎ。具体条件还要摸索。5)二抗孵育条件:二抗一般室温或37度3０mｉn－1h,具体时间需要摸索,而浓度一般有工作液,若就是浓缩液还要摸索浓度,切记要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度与孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度与孵育时间.最后,荧光素标记得二抗随着保存时间得延长,可能后有大量得游离荧光素残留,需要注意配制时小包装与并进行适当得离心。6）复染:目得就是形成细胞轮廓,从而更好地对目标蛋白进行定位。一般常用DＡPＩ复染。7)封片：为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片,此外还有专门得抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡,方法就是直接在载玻片组织上滴一滴封片液,然后一手拿住盖片某一拐角,而另一手拿对面得那个拐角，接近封片液近端得拐角先降低，直至接触到液体时为止;当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢降低另一拐角，这样一般不会产生气泡。8）切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗(延长时间与增多次数)尤为重要,我一般在一抗孵育前得清洗就是３min＊3次,而一抗孵育后得清洗均为５次*５miｎ。注意(1)单独冲洗，防止交叉反应造成污染。(2)温柔冲洗，防止切片得脱落。我喜欢用浸洗方式；（3)冲洗得时间要足够,才能彻底洗去结合得物质。(４）PBＳ得PH与离子强度得使用与要求。这方面我有惨痛教训,当时我买得抗体稀释液偏酸,结果背景一片黄（未见特异性染色）,建议PＨ在7、4—7、6浓度就是0、01M。(中性及弱硷性条件(PＨ７-8)有利于免疫复合物得形成,而酸性条件则有利于分解;低离子强度有利于免疫复合物得形成,而高离子强度则有利于分解） 9)拍照:有条件得话最好立即拍照,若不能及时拍照,也要封好片与用指甲油封固,保持避光与湿度。使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作,不要随意改变程序;应在暗室中进行检查；防止紫外线对眼睛得损害,在调整光源时应戴上防护眼镜；检查时间每次以1～2h为宜，超过９0min,超高压汞灯发光强度逐渐下降,荧光减弱;标
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结
