实验一 分子生物学实验室常用仪器设备简介
一、实验目的
熟悉分子生物学实验室常用仪器并熟练使用 二、实验原理
1、恒温气浴摇床：用于对温度和振荡频率有较高要求的细菌培养，发酵，杂交，生化反应及酶和组织研究等。
2、超净工作台：用于分子生物学无菌操作。
3、低温台式高速离心机：用于分离纯化DNA和蛋白质等，如基因片段的分离，蛋白酶的沉淀和回收等。
4、微量移液管：是连续可调的，计量和转移液体的专用仪器，其装有直接读数容量计。有多种规格：①0.5-10μL②10-100μL③20-200μL④100-1000μL。
5、电泳仪：用于确定大分子物质的分子量以及鉴定物种亲缘关系的仪器。
6、PCR仪：用于目的基因的扩增，是一对寡糖核苷酸引物结合到正负DNA链上的靶序列两侧，从而酶促合成拷贝数为百万倍的靶序列DNA片段。主要用于基础研究和应用研究等领域。
7、灭菌锅：用于细菌和细胞培养及核酸等有关实验使用的试剂，器皿及实验用具的严格灭菌。
三、实验仪器
恒温气浴摇床、超净工作台、低温台式高速离心机、微量移液管、灭菌锅、PCR仪、电泳仪。
四、实验步骤
（一）、恒温气浴要穿的使用： 1、样品瓶牢固放入弹簧夹中
2、接通电源开关，仪器进入准备状态 3、参数设定，（设定温度、时间、转速等参数 ）
4、按启动键仪器开始工作，按暂停键可暂停托盘的旋转； 5、按电源键，显示屏显示消失，关闭电源总开关 （二）、超净工作台的使用
1、使用工作台时，先经过清洁液浸泡的纱布擦拭台面，然后用消毒剂擦拭消毒。 2、接通电源，提前30分钟打开紫外灯照射消毒，处理净化工作区内工作台表面积
累的微生物，15分钟后，关闭紫外灯，开启送风机。
3、工作台面上，不要存放不必要的物品，以保持工作区内的洁净气流不受干扰。 4、操作结束后，清理工作台面，收集各废弃物，关闭风机及照明开关，用清洁剂及消毒剂擦拭消毒。
5、最后开启工作台紫外灯，照射消毒30分钟后，关闭紫外灯，切断电源。 （三）、低温台式高速离心机的使用
1、把离心机放置于平面桌或平面台上，目测使之平衡，用手轻摇一下离心机，检查离心机是否放置平衡。
2、打开门盖，将离心管放入转子内，离心管必须成偶数对称放入，且要事先平衡，完毕用手轻轻旋转一下转子体，使离心管架运转灵活。
3、关上门盖，注意一定要使门盖锁紧，完毕用手检查门盖是否关紧。
4、插上电源插座，按下电源开关（电源开关在离心机背面，电源座上方）。 5、设置转子号、转速、时间：
在停止状态下时，用户可以设置转子号、转速、时间，此时离心机处于设置状态，停止灯亮、运行灯闪烁；按下启动离心开始
（常用，最高转速为13000r/min，时间最长为20分钟）；
注意：对应的转子一定要设置在相应的转速范围内，不可超速使用，否则对试管或转子有损坏。
6、离心机时间倒计时到“0”时，离心机将自动停止，当转子停转后，打开门盖取出离心管，关断电源开关。
（四）、微量移液管的使用
1． 将微量移液器装上吸头（不同规格的移液器用不同的吸头） 2． 将微量移液器按钮轻轻压至第一停点；
3． 垂直握持微量移液器，使吸嘴浸入液样面下几毫米，千万不要将吸嘴直接插到液体底部；
4． 缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样液。否则液体进入吸嘴太快，导致液体倒吸入移液器内部，或吸入体积减少； 5． 等一秒钟后将吸嘴提离液面
6． 平稳地把按钮压到第一停点，再把按钮压至第二停点以排出剩余液体； 7． 提起微量移液器，然后按吸嘴弹射器除去吸嘴。
（五）、PCR的使用
1、开机：打开开关，视窗上显示“SELF TEST”。 2、放入样品管，关紧盖子。
3、如果要运行已经编好的程序，则直接按《Proceed》， 用箭头键选择已储存的程序，按《Proceed》，则开始执行程序。
4、如果要输入新的程序，则在RUN-ENTER菜单上用箭头键选择ENTER PROGRAM,按《Proceed》，
1）命名新的程序，最多8个字母，输入后按《Proceed》确认(如何输入字母、数字)。 2）输入程序步骤：名字输入后，确认，然后输入相关程序
5、输入完成的程序后，到RUN-ENTER菜单，选择新程序，开始运行。 6、其它：用《pause》可以暂停一个运行的程序，再按一次继续程序。用《stop》或《Cancel》可停止运行的程序。
（六）、 电泳仪的使用
1． 首先用导线将电泳槽的两个电极与电泳仪的直流输出端联接，注意极性不要接反。 2．按电源开关，显示屏出现“欢迎使用DYY-12型电脑三恒多用电泳仪…”等字样后，同时系统初始化，蜂鸣4声，设置常设置。屏幕转成参数设置状态，根据工作需要选择稳压稳流方式及电压电流范围。 3．确认各参数无误后，按“启动”键，启动电泳仪输出程序。在显示屏状态栏中显示Start! 并蜂鸣4声，提醒操作者电泳仪将输出高电压，注意安全。之后逐渐将输出电压加至设置值。同时在状态栏中显示“Run”，并有两个不断闪烁的高压符号，表示端口已有电压输出。在状态栏最下方，显示实际的工作时间（精确到秒）
4．电泳结束，仪器显示：“END”，并连续蜂鸣提醒。此时按任一键可止鸣
（七）、高压灭菌锅
1、开盖：转动手轮，使锅盖离开密封圈，添加蒸馏水刚没至板上
2、通电：将控制面板上电源开关按至ON处，若水位低（LOW）红灯亮
3、堆放物品：需包扎的灭菌物品，体积不超过200mm×100mm×100mm为宜，各包装之间留有间隙，堆放在金属框内，这样有利 于蒸汽的穿透，提高灭菌效果 ，灭菌时间： 121℃， 20min，；如为液体，液体必须装在可耐高温的玻璃器皿中，且不可装满，2/3即可， 121℃， 18-20min
4、密封高压锅：推横梁入立柱内，旋转手轮，使锅盖下压，充分压紧 5、设定时间和温度，开始灭菌
6、灭菌结束，所有东西放入干燥箱干燥，排尽水气 五、思考题
1、列出分子生物学常用仪器的名称，用途及操作时的注意事项。
答：①恒温气浴摇床：常用于液体摇匀以培养微生物、细菌和细胞等。注意要依据不同的用途设置不同的参数。②超净工作台：常用于为微生物学实验提供无菌操作环境。注意操作时关掉紫外灯，避免给人类带来伤害。③低温台式高速离心机：常用于分离纯化蛋白、病毒、细胞等。使用时不能随便移动离心机或打开盖子；离心机运行时要处于锁定状态；离心管的放置要处于平衡状态。④微量移液管：用于计量和转移微量液体的专用仪器。操作时注意避免枪头的污染；调节刻度时不宜超过最大量程；使用完后将刻度调到最大收藏。⑤电泳仪：可对不同物质进行定性或定量分析，或将一定混合物进行组分分析或单个组分的提取制备。操作时不可把导线极性接反；当电泳仪进入工作状态后，避免人体与其各部分的接触，不同介质支持物的电泳不要同时在同一电泳仪上进行；若使用时出现异常，要立刻切断电源。⑥PCR仪：用于扩增DNA片断。操作时应注意盖子要盖紧，按正确步骤进行。⑦高压高温灭菌锅：用于杀菌消毒。使用时应严格按照规程操作，避免发生安全事故。
实验二 琼脂糖凝胶电泳的制备及核酸检测
一. 实验目的
1、掌握琼脂糖凝胶电泳的原理; 2、学习琼脂糖凝胶电泳的操作。 二. 实验原理
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。
DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。 溴化乙锭（EB）未扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA含量成正比。 三、仪器和试剂
仪器： 微量移液器，电泳仪，电泳槽，微波炉
试剂： 琼脂糖：1.0%；电泳缓冲液（50 × TAE 电泳缓冲液取Tris24.2g ，冰醋酸
5.7ml ， 0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml ，加蒸馏水至100ml ） EB：5 μl / 100 ml TBE
电泳材料：标准分子量核酸（DL2000） 四. 操作步骤
（1）制胶（以20 mL为例）
a. 称取0.2 g 琼脂糖，加入20 ml 的1XTAE缓冲液（pH 8.0），摇匀； b. 微波炉加热，至琼脂糖完全溶解（要防止过热溢出三角瓶）；
c.将制胶板放入制胶槽中，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）加入2ul EB后，混均匀，倒入其中，直至厚度为4～6 mm（如有气泡要把气泡赶出），在室温下冷却凝固(约30~ 45 min)；
d.小心垂直向上拔出梳子,以保证点样孔完好,将胶板置于电泳槽中。 （2）点样
用微量移液器将5 μl含蓝色染液的 DL2000 加入点样孔下部。 （3）电泳
打开电源开关，调节电压至3~5 V/cm(约100 V)，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约30-40分钟后即可观察结果。 （4）观察
将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计该样品DNA的浓度。如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳，则可通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。 五、实验结果
点样时效果较好的照片点出的白色荧光线比较亮，条带粗细均匀；条带没有出现两端粗中间细的情况 六、思考题
1、做琼脂糖凝胶电泳应注意哪些问题。
答：①EB为强致癌剂，使用时一定要戴手套，避免造成伤害。EB废液要进行正确的处理。②制胶过程中要注意细节，用微波炉加热时要分三步，每步只加热十秒，且要用不戴手套的那只手开微波炉，以免污染。③拔梳子时要垂直向上拔出，以防破坏点样孔。④点样时要小心，既要将样品点到样孔里，又不至于将点样孔戳破。⑤接电源时不可把正负极接反。
实验一 分子生物学实验室常用仪器设备简介.
