实验一 分子生物学实验室常用仪器设备简介
一、实验目的
熟悉分子生物学实验室常用仪器并熟练使用 二、实验原理
1、恒温气浴摇床:用于对温度和振荡频率有较高要求的细菌培养,发酵,杂交,生化反应及酶和组织研究等。
2、超净工作台:用于分子生物学无菌操作。
3、低温台式高速离心机:用于分离纯化DNA和蛋白质等,如基因片段的分离,蛋白酶的沉淀和回收等。
4、微量移液管:是连续可调的,计量和转移液体的专用仪器,其装有直接读数容量计。有多种规格:①0.5-10μL②10-100μL③20-200μL④100-1000μL。
5、电泳仪:用于确定大分子物质的分子量以及鉴定物种亲缘关系的仪器。
6、PCR仪:用于目的基因的扩增,是一对寡糖核苷酸引物结合到正负DNA链上的靶序列两侧,从而酶促合成拷贝数为百万倍的靶序列DNA片段。主要用于基础研究和应用研究等领域。
7、灭菌锅:用于细菌和细胞培养及核酸等有关实验使用的试剂,器皿及实验用具的严格灭菌。
三、实验仪器
恒温气浴摇床、超净工作台、低温台式高速离心机、微量移液管、灭菌锅、PCR仪、电泳仪。
四、实验步骤
(一)、恒温气浴要穿的使用: 1、样品瓶牢固放入弹簧夹中
2、接通电源开关,仪器进入准备状态 3、参数设定,(设定温度、时间、转速等参数 )
4、按启动键仪器开始工作,按暂停键可暂停托盘的旋转; 5、按电源键,显示屏显示消失,关闭电源总开关 (二)、超净工作台的使用
1、使用工作台时,先经过清洁液浸泡的纱布擦拭台面,然后用消毒剂擦拭消毒。 2、接通电源,提前30分钟打开紫外灯照射消毒,处理净化工作区内工作台表面积
累的微生物,15分钟后,关闭紫外灯,开启送风机。
3、工作台面上,不要存放不必要的物品,以保持工作区内的洁净气流不受干扰。 4、操作结束后,清理工作台面,收集各废弃物,关闭风机及照明开关,用清洁剂及消毒剂擦拭消毒。
5、最后开启工作台紫外灯,照射消毒30分钟后,关闭紫外灯,切断电源。 (三)、低温台式高速离心机的使用
1、把离心机放置于平面桌或平面台上,目测使之平衡,用手轻摇一下离心机,检查离心机是否放置平衡。
2、打开门盖,将离心管放入转子内,离心管必须成偶数对称放入,且要事先平衡,完毕用手轻轻旋转一下转子体,使离心管架运转灵活。
3、关上门盖,注意一定要使门盖锁紧,完毕用手检查门盖是否关紧。
4、插上电源插座,按下电源开关(电源开关在离心机背面,电源座上方)。 5、设置转子号、转速、时间:
在停止状态下时,用户可以设置转子号、转速、时间,此时离心机处于设置状态,停止灯亮、运行灯闪烁;按下启动离心开始
(常用,最高转速为13000r/min,时间最长为20分钟);
注意:对应的转子一定要设置在相应的转速范围内,不可超速使用,否则对试管或转子有损坏。
6、离心机时间倒计时到“0”时,离心机将自动停止,当转子停转后,打开门盖取出离心管,关断电源开关。
(四)、微量移液管的使用
1. 将微量移液器装上吸头(不同规格的移液器用不同的吸头) 2. 将微量移液器按钮轻轻压至第一停点;
3. 垂直握持微量移液器,使吸嘴浸入液样面下几毫米,千万不要将吸嘴直接插到液体底部;
4. 缓慢、平稳地松开控制按钮,吸上样液。否则液体进入吸嘴太快,导致液体倒吸入移液器内部,或吸入体积减少; 5. 等一秒钟后将吸嘴提离液面
6. 平稳地把按钮压到第一停点,再把按钮压至第二停点以排出剩余液体; 7. 提起微量移液器,然后按吸嘴弹射器除去吸嘴。
(五)、PCR的使用
1、开机:打开开关,视窗上显示“SELF TEST”。 2、放入样品管,关紧盖子。
3、如果要运行已经编好的程序,则直接按《Proceed》, 用箭头键选择已储存的程序,按《Proceed》,则开始执行程序。
4、如果要输入新的程序,则在RUN-ENTER菜单上用箭头键选择ENTER PROGRAM,按《Proceed》,
1)命名新的程序,最多8个字母,输入后按《Proceed》确认(如何输入字母、数字)。 2)输入程序步骤:名字输入后,确认,然后输入相关程序
5、输入完成的程序后,到RUN-ENTER菜单,选择新程序,开始运行。 6、其它:用《pause》可以暂停一个运行的程序,再按一次继续程序。用《stop》或《Cancel》可停止运行的程序。
(六)、 电泳仪的使用
1. 首先用导线将电泳槽的两个电极与电泳仪的直流输出端联接,注意极性不要接反。 2.按电源开关,显示屏出现“欢迎使用DYY-12型电脑三恒多用电泳仪…”等字样后,同时系统初始化,蜂鸣4声,设置常设置。屏幕转成参数设置状态,根据工作需要选择稳压稳流方式及电压电流范围。 3.确认各参数无误后,按“启动”键,启动电泳仪输出程序。在显示屏状态栏中显示Start! 并蜂鸣4声,提醒操作者电泳仪将输出高电压,注意安全。之后逐渐将输出电压加至设置值。同时在状态栏中显示“Run”,并有两个不断闪烁的高压符号,表示端口已有电压输出。在状态栏最下方,显示实际的工作时间(精确到秒)
4.电泳结束,仪器显示:“END”,并连续蜂鸣提醒。此时按任一键可止鸣
(七)、高压灭菌锅
1、开盖:转动手轮,使锅盖离开密封圈,添加蒸馏水刚没至板上
2、通电:将控制面板上电源开关按至ON处,若水位低(LOW)红灯亮
3、堆放物品:需包扎的灭菌物品,体积不超过200mm×100mm×100mm为宜,各包装之间留有间隙,堆放在金属框内,这样有利 于蒸汽的穿透,提高灭菌效果 ,灭菌时间: 121℃, 20min,;如为液体,液体必须装在可耐高温的玻璃器皿中,且不可装满,2/3即可, 121℃, 18-20min
4、密封高压锅:推横梁入立柱内,旋转手轮,使锅盖下压,充分压紧 5、设定时间和温度,开始灭菌
6、灭菌结束,所有东西放入干燥箱干燥,排尽水气 五、思考题
1、列出分子生物学常用仪器的名称,用途及操作时的注意事项。
答:①恒温气浴摇床:常用于液体摇匀以培养微生物、细菌和细胞等。注意要依据不同的用途设置不同的参数。②超净工作台:常用于为微生物学实验提供无菌操作环境。注意操作时关掉紫外灯,避免给人类带来伤害。③低温台式高速离心机:常用于分离纯化蛋白、病毒、细胞等。使用时不能随便移动离心机或打开盖子;离心机运行时要处于锁定状态;离心管的放置要处于平衡状态。④微量移液管:用于计量和转移微量液体的专用仪器。操作时注意避免枪头的污染;调节刻度时不宜超过最大量程;使用完后将刻度调到最大收藏。⑤电泳仪:可对不同物质进行定性或定量分析,或将一定混合物进行组分分析或单个组分的提取制备。操作时不可把导线极性接反;当电泳仪进入工作状态后,避免人体与其各部分的接触,不同介质支持物的电泳不要同时在同一电泳仪上进行;若使用时出现异常,要立刻切断电源。⑥PCR仪:用于扩增DNA片断。操作时应注意盖子要盖紧,按正确步骤进行。⑦高压高温灭菌锅:用于杀菌消毒。使用时应严格按照规程操作,避免发生安全事故。
实验二 琼脂糖凝胶电泳的制备及核酸检测
一. 实验目的
1、掌握琼脂糖凝胶电泳的原理; 2、学习琼脂糖凝胶电泳的操作。 二. 实验原理
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,沸水中溶解,45℃开始形成多孔性刚性滤孔,凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。
DNA分子在碱性环境中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应。不同DNA,其分子量大小及构型不同,电泳时的泳动率就不同,从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA,主要是利用分子筛效应,迁移速度与分子量的对数值成反比关系。 溴化乙锭(EB)未扁平状分子,在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物,其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上,且荧光强度与DNA含量成正比。 三、仪器和试剂
仪器: 微量移液器,电泳仪,电泳槽,微波炉
试剂: 琼脂糖:1.0%;电泳缓冲液(50 × TAE 电泳缓冲液取Tris24.2g ,冰醋酸
5.7ml , 0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml ,加蒸馏水至100ml ) EB:5 μl / 100 ml TBE
电泳材料:标准分子量核酸(DL2000) 四. 操作步骤
(1)制胶(以20 mL为例)
a. 称取0.2 g 琼脂糖,加入20 ml 的1XTAE缓冲液(pH 8.0),摇匀; b. 微波炉加热,至琼脂糖完全溶解(要防止过热溢出三角瓶);
c.将制胶板放入制胶槽中,插入适当的梳子,将溶解的琼脂糖(约50℃)加入2ul EB后,混均匀,倒入其中,直至厚度为4~6 mm(如有气泡要把气泡赶出),在室温下冷却凝固(约30~ 45 min);
d.小心垂直向上拔出梳子,以保证点样孔完好,将胶板置于电泳槽中。 (2)点样
用微量移液器将5 μl含蓝色染液的 DL2000 加入点样孔下部。 (3)电泳
打开电源开关,调节电压至3~5 V/cm(约100 V),可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动,约30-40分钟后即可观察结果。 (4)观察
将电泳好的胶置于紫外透射检测仪上,打开紫外灯,可见到橙红色核酸条带,根据条带粗细,可粗略估计该样品DNA的浓度。如同时有已知分子量的标准DNA进行电泳,则可通过线性DNA条带的相对位置初步估计样品的分子量。 五、实验结果
点样时效果较好的照片点出的白色荧光线比较亮,条带粗细均匀;条带没有出现两端粗中间细的情况 六、思考题
1、做琼脂糖凝胶电泳应注意哪些问题。
答:①EB为强致癌剂,使用时一定要戴手套,避免造成伤害。EB废液要进行正确的处理。②制胶过程中要注意细节,用微波炉加热时要分三步,每步只加热十秒,且要用不戴手套的那只手开微波炉,以免污染。③拔梳子时要垂直向上拔出,以防破坏点样孔。④点样时要小心,既要将样品点到样孔里,又不至于将点样孔戳破。⑤接电源时不可把正负极接反。
实验一 分子生物学实验室常用仪器设备简介.
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