流式细胞仪操作规程目录
1：淋巴细胞亚群测定 2：HLA-B27测定
淋巴细胞亚群测定
(CD系列)
方法
流式细胞仪BD)
原理：
用已知总数的荧光微球Beads作标准内参，加入血中，再加入荧光抗体，应用流式细胞仪的获取和分析软件，就可以得出血中CD3、CD4，CD8、B、NK细胞的绝对数。
细胞（/ul）=获取细胞数×Beads总量Beads获取数×样本量
标本采集与处理
受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。 采集部位 静脉采血 抗凝剂 EDTA抗凝血 要求 1．样本量至少1ml。
2．室温放置，24小时内处理，处理前充分混匀。 3．溶血样本不能用。
试剂 (1)
质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。
仪器
BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra
样本制备：
1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照 2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。 3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟 4)溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血) b. 使用COULTER Q—PREP制备系统
开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。 （*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体） 5)上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样）
报告结果
报告百分数（和绝对值）
操作性能
精密度 批内五次重复CV<2％ 灵敏度 500—1000个荧光素分子
参考值(百分数（绝对值）)
CD3+ 60.8-75.4%(1141-1880) CD4+ 29.4-45.8%(478-1072) CD8+ 18.2-32.8%(393-742) NK 9.5-23.5% (175-567) Th/Ts 1.05-2.03
临床意义
1.T、B淋巴细胞亚群是重要的免疫状态检测指标，在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染，自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床诊断、病情判断、治疗等价值。
临床常用Th／Ts比值来判断病人的免疫状况。
Th／Ts比值升高：表示免疫功能亢进：见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及HBsAg+乙肝等。
Th／Ts比值减低：表示免疫功能下降：艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝和活动性肝硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者。
2：NK细胞主要破坏各种肿瘤细胞和感染某些病毒、细菌的细胞，所以在抗肿瘤和防御疾病中起主要作用。NK活性减低主要见于各种恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、应用免疫抑制剂，疲劳综合征病人等，NK活性随年龄增长而减退。NK细胞也参与第二型超敏反应和移植物抗宿反应，白介素-2治疗后；外周血NK细胞增加。
方案（Protocol）
HLA-B27测定 (流式细胞仪) 医院检验科 操作规程文件号： 200 年 月 日起实施 第1版 (共3页) 本规程每2年复审一次 复审日期： 年 月 日 复审人： 规程编写者： 审 批 者： 批准日期： 年 月 日
文件分发部门和／或个人 院档案室保管者： 检验科 主任： 检验科 实验室： HLA-B27测定 方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)
原理：
双色直接免疫荧光法。将HLA-B27-FITC/B7-PE单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗体结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，测定HLA-B7阴性而HLA-B27阳性细胞的平均荧光强度和所占的百分比。
标本采集与处理
受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态，空腹采血。 采集部位 静脉采血
抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 要求 1．样本量至少1ml。
2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本不能用。
3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核 细胞。 4．溶血样本不能用。
试剂
品牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特
成分 1：单克隆抗体 液体 1ML 2—8℃ 2：全血溶血试剂 液体
A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 3：鞘液 液体 20L 室温 4：清洗液 液体 5L 室温 5：荧光微球 液体 10ML 2-8℃
质控品 BEKAMANCOULTER产品，未开瓶的试剂于2-8℃保存，可在有效期内保持稳定，稀释的试剂于2-8℃可稳定2周；每天校准一次：遇特殊情况随时进行校准。
仪器
BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra
样本制备：
1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入20 ul单克隆抗体和同型对照(IgG2a-FITC／IgG1-PE) 2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。 3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟 4)溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血) b. 使用COULTER Q—PREP制备系统
开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。 （*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）
5)洗、离心、上机测样（备注： 测B27一定要至少洗一遍方可上机检测）
报告结果 报告阴阳性
操作性能
精密度 批内五次重复CV<2％ 灵敏度 500—1000个荧光素分子
流式细胞仪SOP示例
