生产用细胞Vero 细胞残余DNA的致瘤性质量标准：80年代美国FDA → 10pg /剂欧盟、WHO → 100pg /剂我国卫生部→ 100pg /剂90年代后期WHO 推荐为→ 10ng/剂2000年版《中国生物制品规程》→ 10ng/剂2010版《中国药典》三部→ 100pg /剂检测灵敏度：1-10pg/mlNational Institutes for Food and Drug Control病毒性灭活疫苗关键点3-1 生产工序和/或步骤毒种检定毒种细胞处理动物，选取所用组织接种清除牛血清抗菌素浸泡清洗组织，剪碎，传代细胞工作库用自然沉降法清洗细胞复苏无牛血清洗换培养液加胰酶消化组织培养液，牛血清，培养液分散成细胞抗生素，调节pH培养病毒滴定传代细胞扩增无菌试验支原体收获病毒液可多次分装转瓶培养预留5％或至少500ml作对照不同灭活剂、灭不同灭活剂灭合并无菌试验观察14天或至活方法、程序病毒液收获结束灭活验证试验最敏感方法灭浓立即取样活缩膜过滤，截留量大小、倍数National Institutes for Food and Drug Control转下页11病毒性灭活疫苗关键点3-2 生产工序和/或步骤无菌试验柱层析单柱、多柱区带离心纯化抗原含量测定蛋白量测定其它方法牛血清白蛋白DNA人白蛋白配制宿主蛋白防腐剂抗生素佐剂抗生素半成品无菌试验NO鉴别试验外观分装化学pH厡容器分装防腐剂亚批的概念（水份保持均匀冻干液体佐剂）效力试验热稳定试验无菌试验成品细菌内毒素或热源异常毒性等National Institutes for Food and Drug Control病毒性灭活疫苗关键点4-1 灭活剂和灭活方法福尔马林甲醛甲醛溶液（浓度定义）灭活剂的作用原理作用原理：改变病毒蛋白成分,与蛋白中的氨基结合，直接使氨基酸或氨基基团暴露，使其变性而起作用，与氨基酸的酰胺或胍基团形成铰链，从而使病毒蛋白质变性以阻碍核酸从病毒颗粒中释放。使病毒失去感染力。灭活用剂量：1/2000-1/4000灭活方法：冷灭活4℃ 热灭活热灭活22-37 ℃甲型肝炎1/4000 36℃ ?6天乙型脑炎（中国地鼠肾细胞）1/2000 22℃ ?8天乙型脑炎（日本鼠脑纯化）0 .06% 4℃ ?50 -60天狂犬病疫苗1/4000 37℃ ?1 -2天残留量：疫苗内残留量不得大于1/2000National Institutes for Food and Drug Control12病毒性灭活疫苗关键点4-2 灭活剂和灭活方法注意点：pH、温度、浓度和作用时间优点：价廉、灭活方法简单易操作缺点：残余甲醛的形式不变，使疫苗的稳定性差，注射时局部疼痛。甲醛+ 病毒蛋白?羟甲基化合物（此反应为可逆）羟甲基化合物+ 酰胺或胍基团?亚甲桥化合物（形成交联、不可逆）——这种作用发生病毒颗粒的聚集，因此也限制了甲基对病毒颗粒内部核酸的作用酸的作用，在这种情况下，尽管病毒蛋白已破坏，但有一些病毒仍会具有在这种情况下尽管病毒蛋白已破坏但有些病毒仍会具有感染性。National Institutes for Food and Drug Control病毒性灭活疫苗关键点4-3 灭活剂和灭活方法丙内脂：易水解、须使用95％以上作用原理：直接作用于病毒的DNA或RNA ，打断病毒的核酸,使其不能复制遗传物质而起作用，不破坏病毒的外壳蛋白。?-PL ?水解??-羟丙酸（无毒）灭活方法：灭活（4℃ 20小时）?水解（37 ℃ 2小时）灭活用剂量：1/2000-1/4000残留量：无注意点：pH、温度、浓度和作用时间优点：灭活时间短，疫苗中无残余，不破坏病毒抗原，不影响疫苗的稳定性缺点：价格昂贵，国内无产品，产品很不稳定易水解，原液本身具有一定的拟致癌性National Institutes for Food and Drug Control13病毒性灭活疫苗关键点5 浓缩背景：目前细胞培养的疫苗基本均为纯化疫苗，要求的抗原量大，一般须有病毒抗原的浓缩工艺；原理：浓缩多采用超滤膜技术，利用不同孔径的膜，截留流体中一定大小范围的颗粒或分子，使水份去除得以浓缩。影响因素：－膜孔径的大小－膜及其装置的完整性膜其装完性－待浓缩样品中细胞碎片的残留，应先澄清；－膜对特定抗原的非特异性吸附National Institutes for Food and Drug Control病毒性灭活疫苗关键点6-1 纯化方法和纯度要求纯化－柱层析?设备、条件较简单，规模可大可小，价格低廉；优?已有电脑程序控制，操作简单，放大不走样；?介质可再生，反复使用，因此使用成本小；介质可再生反复使用因此使用成本小点?纯化条件温和，样品的生物学活性保持好；?分离能力强，效果好；?一般为常压，即使分离活病毒也较安全。1、凝胶过滤技术（分子筛层析、体积排阻层析）原理：利用网状或锥形微孔结构的凝胶根据分子大小进行分离。2、离子交换层析原理：通过物质的电荷与离子交换剂所带的电荷间的相互作用达到分离目的。影响因素：介质重复使用，清洗、活化不佳严重影响纯化；柱床体积与加样量不适配和随意改变；系统的pH、离子强度、温度等条件的变化；在线检测系统故障；操作人员的变动等。National Institutes for Food and Drug Control14病毒性灭活疫苗关键点6-2 纯化方法和纯度要求纯化－超速离心原理：由于病毒粒子已经小到在悬液或胶体溶液中不能自然沉降，离心纯化就是在离心力场的作用力加各种密度的介质使其沉降，达到分离纯化的目的。影响因素：－糖、氯化铯或溴化钾等介质的质量－加样量－离心时间、温度和速度－收取量是否按规定收获组分，扩收一点杂质多，纯度差。National Institutes for Food and Drug Control病毒性灭活疫苗关键点7 疫苗的添加剂牛血清：－应使用来源于经达标检查合格的企业之牛血清；－质量应符合《中国药典》（三部2010版）有关牛血清的标准；－特别是支原体、大肠杆菌噬菌体、及相关的病毒应检测阴性；－生产生产乙脑疫苗时还须注意抗乙脑病毒的抗体应阴性脑疫苗时须注意抗脑病毒的抗体应阴性人白蛋白:－应来源于合法生产企业－所用人白蛋白应由批签发证明－所用人白蛋白的效期应能保证在疫苗效期内仍然有效抗菌素：－在疫苗的生产的起始阶段，即细胞培养阶段有些抗菌素可使用，如那霉素、新霉素等，但其它工序中不得再使用抗生素；用如那霉素新霉素等但其序中得再使用抗素；－但不能加青霉素和?-内酰胺类。－在纯化过程中应尽可能去除。冻干保护剂：明胶，应使用猪源或牛皮源的药用明胶，国际上已不用明胶作冻干保护剂National Institutes for Food and Drug Control15
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