原代细胞的要求?对动物脏器组织或胚胎来源的动物应有明确健康状况和洁净级别要求；?不能建立细胞库不能建立细胞库，只能限于原始培养的细胞或传代少数几只能限于原始培养的细胞或传代少数几代内（≤5代）?原代细胞培养物的检查：?细胞培养原材料检查及细胞培养操作?细胞培养物的检查?细胞形态检查?特定病毒检查?对照细胞检查National Institutes for Food and Drug Control生产用细胞原代细胞：地鼠肾、沙鼠肾优点：?来源容易，动物的繁殖快，4-5周出现性周期，怀孕期15-18天，哺乳期20天，产后24-36小时即可发情排卵，一年可产8-10胎。天产后2436小时即可发情排卵年可产810胎?制备的细胞没有遗传物质的突变，比较安全，不必考虑疫苗中的残余DNA；?病毒容易在这些细胞中适应。缺点：?需要建设相应的动物房，污染环境；?制备疫苗需要宰杀大量的动物?动物容易污染细菌、病毒、寄生虫等外源物质。National Institutes for Food and Drug Control6连续传代细胞系的特殊要求?生产用细胞代次：最高代次须符合要求(或经批准)；?生产过程中的细胞检查：除另有规定外，在生产末期，取不接种病毒的细胞作为对照，至少进行细胞鉴别试验、支原体检查、对照细胞外源病毒因子检测，应符合要求。National Institutes for Food and Drug Control人二倍体细胞株的特殊要求?新建的人二倍体细胞株（资料：建立细胞株所用胎儿的胎龄和性别、终止妊娠的原因、所用胎儿父母的年龄、职业及健康良好的证明，以及胎儿父系及母系三代应无明显遗传缺陷疾病历史的书面材料）?染色体检查：对新建、遗传修饰的细胞株需要；对已建株如2BS、MRC：对新建遗传修饰的细胞株需要；对已建株如2BSMRC-5等5等，在建立MCB时可在建立MCB时可不必检查?无菌、支原体检查：每8~12世代细胞培养物?病毒检查：传代过程中，至少对2个不同世代水平进行病毒包含体、HBV、HCV、EB、HIV等进行检查，应为阴性。?致瘤性检查：每8~12世代应做一次，应为阴性。?生产过程中的细胞检查：?染色体检查：通常对于含有活细胞的制品或下游纯化工艺不足的制品；对已建株的人二倍体细胞生产则不要求对已建株的人二倍体细胞生产则不要求；?细胞鉴别试验：每年应至少检查一次该项试验；?无菌、支原体检查?对照细胞外源病毒因子检测National Institutes for Food and Drug Control7病毒性灭活疫苗二倍体细胞2BSMRC-5关键点2-3 生产用基质细胞,传代细胞库1、冻存于液氮传代细胞VeroCHO2、一式两份保存式两份保存3、细胞库台帐与实物一致4、细胞管标签：原始细胞库细胞名称细胞库的建立主细胞库工作细胞库细胞批号引进的细胞一般为主细胞和工作细胞库细胞代次细胞数/ml 细胞鉴别试验管号无菌检查制备日期支原体检查细胞内、外源病毒因子检查（外源因子，特别是逆转录病毒）致瘤性必要时：染色体核型检查National Institutes for Food and Drug Control病毒性灭活疫苗关键点2-4 传代细胞库二倍体细胞?具有正常二倍体（2n）染色体的数目，核型正常；?在培养条件下，不能无限期的分裂繁殖；?无肿瘤原性，保留原体内细胞特性。常见的二倍体细胞：WI-38 IMR-90 MRC-5 2BS KMB-17二倍体细胞代次的计算：以细胞群体倍增计算，以每个培养容器细胞群体细胞数为基础，每增加一倍作为一世代，即一瓶细胞传二瓶（1：2分种率），再涨满瓶为一世代；一瓶细胞传四瓶(1：4)为二世代；一瓶细胞传八瓶(1：8)为三世代。National Institutes for Food and Drug Control8病毒性灭活疫苗关键点2-6 传代细胞库——取自同批工作细胞库的1支或多支细胞管，经复苏、扩增后的细胞仅用于一批疫苗的生产经复苏、扩增后的细胞仅用于批疫苗的生产细胞传代次数：1 2 3 4 5 6 7 8 10 11 120001 1 2 4 8 16 32 64 128 256疫苗0002 4 8 （8）16 32 64 128 256批号0003 8 （8）16 32 64 128 2560004 8 16 32 64 128 256National Institutes for Food and Drug Control病毒性灭活疫苗关键点2-5 传代细胞库Vero细胞用于疫苗生产的优缺点优点：11、传代细胞系，几乎可以取之不竭传代细胞系几乎可以取之不竭2、已经全面检定，其特性符合人用疫苗的生产，细胞库一经建立，细胞质量可高度控制3、该细胞生长条件要求不高，容易培养繁殖；4、可用生物反应器大规模生产5、大多数病毒能在该细胞系中复制繁殖6、疫苗生产不要动物缺点缺点：1、由于是传代细胞系，有一定的致肿瘤性；疫苗必须纯化，且细胞DNA含量1由于是传代细胞系有定的致肿瘤性疫苗必须纯化且细胞DNA含量须达到标准2、目前不适合活疫苗的生产National Institutes for Food and Drug Control9生产用细胞Vero细胞疫苗的研究Vero细胞的来源和历史V细胞的来源和历史日本Chiba大学的Yasumura 于1963年3月取自非洲绿猴肾。建立该细胞系是为了研究SV-40与肿瘤的关系；Vero细胞的命名：取自世界语的二个字合并而成VERE 绿色的意思；RENO 肾脏的意思VERE 但世界语中无此字型，Yasumura将其改为VERO且VERO在世界语中有真理之意，从而该细胞系定名为VERO。Chiba大学的Simizu博士将该细胞传至93代于1964年6月后送美国国立卫生研究所的热带病毒实验室。热带病毒实验室传至113代交ATCC收藏。National Institutes for Food and Drug Control生产用细胞Vero细胞的致肿瘤性Montagnon实验：用裸鼠进行肿瘤实验，106或107细胞注射裸鼠，同时用H同时用Hela细胞作对照l细胞作对照137-169代：注射部位结节呈退行性变，全部动物无肿瘤发生190-210代：注射部位结节呈进行性变，全部动物出现肿瘤，且半数动物发生肺和淋巴节的肿瘤转移。结论结论：170代以前的细胞是安全的代以前的细胞是安全的National Institutes for Food and Drug Control10
病毒性疫苗new - 图文
