定量蛋白质组学分析方法
钱小红
【期刊名称】色谱
【年(卷),期】2013(031)008 【总页数】5
精确测量多个不同生理或病理条件下生物样本中蛋白质表达量的变化是定量蛋白质组学（quantitative proteomics）研究的重要内容。与传统的蛋白质定量方法（见表1）相比，组学规模的蛋白质定量可以实现在一次实验中对成百上千个蛋白质的定量测定和比较分析，为规模化发现和验证疾病诊断的生物标志物以及发展新的药物靶标提供了重要手段。
近十年来，随着高精度生物质谱技术的发展和基于生物信息学的海量数据处理技术的进步，规模化地精确测量细胞内蛋白质组的表达变化已经成为现实。定量蛋白质组研究方法也从传统的基于二维凝胶电泳（two dimensional electrophoresis，2-DE）结合质谱鉴定的策略向着更高准确度、更大动态范围和更高通量的方向发展。
蛋白质组学定量方法根据是否对蛋白质／多肽进行标记可以分为标记和非标记两类（见表2）；而根据定量目的的不同又可以分为相对定量和绝对定量，前者是对不同样本中相同蛋白质群表达量的相对变化进行分析，而后者是对样本中单个蛋白质或蛋白质组的绝对量或浓度进行测定。目前，基于多重标记的蛋白质组相对定量和基于多反应监测（MRM）针对有限数量的目标蛋白质群的绝对定量方法及其应用发展较快，而采用非标记技术对蛋白质组进行绝对定量分析是未来的重要发展方向。
1 蛋白质组标记定量方法的研究
标记定量方法是基于在肽段中引入稳定同位素标记（如2 H、13C、15 N、18 O），使得在同一次质谱扫描中标记“轻”和“重”同位素的多肽具有相同的色谱行为和离子化效率，此时成对出现的质谱峰信号的相对强度可以精确地反映样品中多肽的丰度比例（蛋白质的比例）。因此该方法具有良好的定量可靠性，不仅可以用于不同样品间的相对定量分析，还可以用于蛋白质的绝对定量分析。 根据稳定同位素掺入的方式，标记方法可以分为代谢标记、酶促标记和化学标记等。经典的体内代谢标记包括 15N体内代谢标记［3］、SILAC［4］等。在此 基础之上对SILAC技术进行扩展，发展了一系列新的方法，如culture-derived isotope tags（CDITs）［5］和SILAC双重（使用两种不同的“重”氨基酸）标记［6］等。近年来，随着MRM的广泛应用，对于大批量内标的需求催生了基于SILAC策略进行重组表达串联体蛋白质（QconCAT，contamers of Q peptides）技术，以规模化制备内标肽段［7］。利用该技术可以将来源于不同蛋白质的特异肽段整合在一个Qcon-CAT蛋白质中。通过在蛋白质重组表达时加入重标氨基酸的方法，得到大量蛋白质的内标肽段，避免了传统的化学合成肽段费时、费力的问题，有利于对目标蛋白质进行相对或绝对的定量分析［8］。
2001年，Fenselau实验室［9］首先将18 O酶切标记的方法用于蛋白质组相对定量的研究。随后，人们不断对此方法进行改进，重点解决其标记效率、标记稳定性和回交等问题。Zhao等［10］使用酶促进剂Rapigest TMSF改善肽段的分散度，使用微波加热提高反应效率，使标准肽段的18O标记效率高达100%；再使用高浓度还原剂和烷基化试剂对胰酶彻底灭活，抑制了18O-16O
回交反应，标记肽段6天内稳定。现在，固定化酶技术的发展大大提高了18O酶切标记的效率和稳定性，利于该标记定量方法的进一步广泛应用。
在标记方法中，化学标记的种类最为繁多，应用也最为广泛。依据标记标签的不同，化学标记可以分为同位素标记和等量异序标签标记。代表性的化学标记方法包括标记多肽（蛋白质）N端氨基的iTRAQ［11］、标记肽段 C 端羧基（-COOH）的酯化标记、针对半胱氨酸巯基（-SH）的ICAT［12］、以及与质谱多反应监测（MRM-MS）技术联用的mTRAQ标记技术［13］等。化学标记定量技术发展的一个重要方向是多重定量标记，如iTRAQ最大的特点就是可以进行八重定量标记，从而大大提高了分析效率。最新的串联质谱标签（tandem mass tag，TMT）最多可以实现十八重标记，再加上高分辨质谱仪的使用［14］，规模化精确定量多种细胞状态下相同蛋白质的表达变化已经变为现实。
金属元素化学标记蛋白质组定量也是近年来发展的一类新方法，也拓展了蛋白质组定量的新思路。与稳定同位素标记方法相比，金属元素标记方法具有试剂价廉易得［15］、可发展成多重标记技术、可与生物质谱和元素有机质谱联用、可用于蛋白质组相对和绝对定量的双重优势［16］等特点。
2 蛋白质组非标记（label free）定量方法的研究
相对于传统的标记定量方法，非标记定量方法不需要在样本分析前对蛋白质／多肽进行标记，避免了样本标记处理环节造成的可能的样品损失，在检测肽段的数量、蛋白质的覆盖率和分析通量方面具有较大优势，且不受样品来源和数量的限制，因而近年来得以迅速发展［17-20］。
传统的非标记定量方法包括准确质量结合色谱保留时间标签法（accurate
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