课题3 血红蛋白的提取与分离
学 习 目 标 1．掌握提取生物大分子的基本过程和方法。(重点) 2．理解凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。(重、难点) 3．尝试对血液中的血红蛋白进行提取和分离。
自主学习·预习热身
一、凝胶色谱法
1．概念：也称做__分配色谱法__，是根据__相对分子质量大小__分离蛋白质的有效方法。 2．原理
当__相对分子质量__不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量__较小__的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程__较大__，移动速度__较慢__，而相对分子质量__较大__的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在__凝胶外部__移动，路程__短__，移动速度__快__，从而使__相对分子质量__不同的蛋白质分子得以分离。
二、缓冲溶液
1．作用：在一定范围内，抵制__外界__的__酸和碱__对溶液pH的影响，维持pH__相对稳定__。
2．配制：由__1～2__种缓冲剂溶解于__水__中配制而成，通过调节缓冲剂的__使用比例__就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。
三、电泳
1．概念：指__带电粒子__在电场的作用下发生的__迁移__的过程。
2．原理：在一定的__pH__下，__多肽__、__核酸__等生物大分子的可解离基团会带上__正电__或__负电__，在__电场__的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷__相反__的电极移动。
3．作用：电泳利用了待分离样品中各种分子__带电性质__的差异及分子本身的__大小__、__形状__的不同，使带电分子产生不同的__迁移速度__，从而实现样品中__各种分子__的分离。
4．方法：常用的电泳方法有__琼脂糖凝胶电泳__和__聚丙烯酰胺凝胶电泳__。测定蛋白质分子量时通常使用__SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳__。
四、实验操作
蛋白质的提取和分离一般分为四步：__样品处理__、__粗分离__、__纯化__和__纯度鉴
课 程 标 准 尝试蛋白质的提取与分离
定__。
1．样品处理
(1)红细胞的洗涤：目的是__去除杂蛋白__。采用__低速短时间__离心，吸取血浆后加__生理盐水__洗涤，直至上清液中没有__黄色__，表明红细胞已洗涤干净。
(2)血红蛋白的释放：在__蒸馏水__和__甲苯__的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。 (3)分离血红蛋白溶液：把混合液离心后，将试管中的液体用滤纸过滤，除去__脂溶性沉淀层__，于分液漏斗中静置片刻后，分离出下层的__红色透明液体__。
(4)透析：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。 2．凝胶色谱操作
(1)凝胶色谱柱的制作：准备材料→加工橡皮塞→安装色谱柱。 (2)凝胶色谱柱的装填。
(3)样品的加入和洗脱。其基本过程是调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质。至此，血红蛋白即可得到粗分离。
3．纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是__SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳__。 五、操作提示
1．红细胞的洗涤：__洗涤次数__、__离心速度__与__离心时间__十分重要。洗涤次数过少，无法除去__血浆蛋白__；离心速度__过高__和时间__过长__会使__白细胞__等一同沉淀，达不到分离效果。
2．色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在__洗脱液__中膨胀，可以将加入其中的湿凝胶用__沸水浴加热__，加速膨胀。
3．凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不能有__气泡__存在。因其能搅乱洗脱液中蛋白质的__洗脱次序__，降低分离效果。
4．蛋白质的分离：如果__红色区带均匀一致地移动__，说明色谱柱制作成功。 思考
红细胞破碎后混合液中含有什么成分？
提示：红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯等。 ┃┃活学巧练__■ 判断题
1．相对分子质量较大的蛋白质，无法进入凝胶内部的通道，移动速度较慢。(×) 分析：相对分子质量较大的蛋白质，无法进入凝胶内部的通道，移动速度较快。 2．在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。(√)
3．电泳法分离样品只取决于蛋白质的相对分子质量大小。(×)
分析：电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的
不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
4．红细胞的洗涤是为了彻底除去杂蛋白，应快速离心。(×)
分析：红细胞的洗涤目的是除去杂蛋白，离心的目的是使红细胞沉淀，而杂蛋白等均在上清液中，应低速缓慢离心，如果高速离心则会导致白细胞等一起沉淀，起不到分离的效果。
5．纯化蛋白质的原理是根据不同蛋白质之间以及蛋白质与其他分子之间存在电荷差异进行的。(×)
分析：纯化蛋白质的方法是凝胶色谱法，利用的是不同蛋白质之间以及蛋白质与其他分子之间存在分子大小的差异进行的。
6．样品处理和粗分离的目的都是除去相对分子质量较小的杂质。(×) 分析：样品处理的目的是除去相对分子质量较大的杂质。 7．透析袋是一种选择透过性膜。(√)
8．SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的依据是蛋白质分子相对分子质量和带电性质的差异。(×)
分析：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳是根据大多数蛋白质都能与阴离子表面活性剂——十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的电荷量，消除了不同蛋白质间的电荷差别，使蛋白质分子电泳迁移率完全取决于相对分子质量的大小。
新知解读·互动探究
知识点
血红蛋白提取和分离的方法
┃┃要点归纳__■
1．依据蛋白质的特性的差异
蛋白质的理化性质(如形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等)千差万别，由此可提取和分离各种蛋白质。
2．蛋白质的分离方法：凝胶色谱法
(1)概念：凝胶色谱法也称做分配色谱法，是根据相对分子质量大小分离蛋白质的有效方法。
(2)原理：大多数凝胶由糖类化合物构成的小球体，内部有许多贯穿的通道，当不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。
3．缓冲溶液
(1)作用：在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。
(2)配制：通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。
4．电泳
(1)概念：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
(2)原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定pH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
┃┃典例评析__■
典例1 分离不同种类的蛋白质依据的原理不包括( D )
A．分子的形状和大小
B．所带电荷的性质和多少、吸附性质 C．对其他分子的亲和力 D．蛋白质分子的组成元素
[解析] 分离不同种类的蛋白质依据的原理包括分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、吸附性质、对其他分子的亲和力和蛋白质分子的溶解度等。蛋白质分子的组成元素不是分离不同蛋白质的依据。
┃┃变式训练__■
1．利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来 ( A ) A．相对分子质量大的 C．相对分子质量小的
B．溶解度高的 D．所带电荷多的
[解析] 凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量大的蛋白质，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。
知识点
提取和分离血红蛋白的实验操作
┃┃要点归纳__■
蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。 1．样品处理的过程
??目的：去除杂蛋白
红细胞洗涤?
?方法：低速短时间离心?
↓
将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏??血红蛋白
?水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯
释放?
?置于磁力搅拌器上充分搅拌10 min↓
第一层：无色透明的甲苯层?
分离血红?第二层：脂溶性物质的沉淀层，白色薄层固体
?蛋白溶液第三层：血红蛋白的水溶液，红色透明
??第四层：其他杂质的暗红色沉淀物。↓
取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析??
透析?袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L
??的磷酸缓冲液中?pH为7.0?，透析12 h。2．凝胶色谱操作的主要步骤
??? 凝?打开流出口：使缓冲液与凝胶面平齐，关闭出口胶? ↓??色用吸管将1 mL样品加到色谱柱顶端，打开出口， ?谱?使样品渗入凝胶床内后，关闭出口操?样品的加? ↓
作入和洗脱?小心加入物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液到适当?
?高度后，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，开始洗脱
? ↓
??待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，??每5 mL收集一管，连续收集?
3．纯度鉴定——SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定的方法中，使用最多的是SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。
4．结果分析与评价 项目 血液样品 ①分层明显→样品处理完成 分析 ?用蒸馏水溶胀凝胶→均匀装填入色谱柱→在约50 cm
凝胶色谱?
?高的操作压下用300 mL浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲
柱的装填?
?液充分洗涤平衡凝胶12 h，使凝胶装填紧密
高中生物人教版选修1配套学案血红蛋白的提取与分离
