将含有总游离蒽醌的氯仿液250ml移至1000ml的大分液漏斗中，加PH8缓冲液（5% NaHCO3溶液）125ml振摇萃取（3次，每次125ml，至碱液无色），静置至彻底分层，放出氯仿液后，倒出碱水液至置500ml烧杯中，加HCl酸化至PH=3，待黄色沉淀析出完全后，过滤、干燥，干燥后的样品加冰醋酸10ml加热使溶，趁热过滤，滤液静置，析出黄色针晶为大黄酸，过滤即得纯品。 大黄素的分离与精制
将提过大黄酸的氯仿液继续移至分液漏斗中，用PH9.9缓冲液（5%NaCO3溶液）125ml振摇萃取（3次，每次125ml，至碱液无色），275ml振摇萃取，彻底分层后，分出碱水层，并用HCl酸化至PH=3，析出棕黄色沉淀，过滤，沉淀经干燥后，用10ml冰醋酸加热使溶，趁热过滤，析出橙色大针晶，过滤后，即得大黄素纯品。
芦荟大黄素的分离和精制
余下氯仿液移至分液漏斗后，加5%NaCO3:5%NaOH (9:1) 碱水液125ml或用0.5%KOH125ml振摇萃取，碱水液加HCl酸化，析出的沉淀过滤干燥，用10ml乙酸乙酯重结晶，得黄色针晶的芦荟大黄素纯品。 3. 鉴定
1.化学检识：分别取总蒽醌提取物少许，用乙醚溶解，做如下反应： A：碱液试验：取试液1ml，加20%NaOH数滴，观察颜色。 B．醋酸镁反应：取试样1ml，加醋酸镁试剂数滴，观察现象。 2．薄层鉴定： 吸附剂：硅胶-CMC
展开剂：C6H6-EtOAc(3:2或97：9)。
显色剂：（1）氨蒸气熏。（2）5%KOH喷雾。 （四）实验指导
1．本实验讲解要点及注意事项。 ① PH梯度萃取的原理及注意事项。 ② 如何设计萃取分离方案的程序与方法。
③ 分离萃取时一定注意乳化层的分出，不要混入，并且每步最好用新鲜CHCl3，回洗碱水液。
⑤ 缓冲液的配制和碱液的配制要准确，严格注意检查。 2．实验报告要求
① 记录大黄总蒽醌的提取方法及总蒽醌的分离程序（包括溶剂用量）。 ② 总蒽醌的显色鉴别结果。
③ 记录大黄素、大黄酸、芦荟大黄素的精制方法及薄层色谱鉴别结果。
实验四 黄连中盐酸小檗碱的提取、精制和鉴定
黄连为毛莨科黄连属植物黄连、三角叶黄连或云连等的干燥根茎。具有清热燥湿、清心除烦、泻火解毒的功效。黄连的有效成分主要是生物碱，已分离出的主要有：小檗碱（ Berberine ），又名黄连素，巴马丁、黄连碱，甲基黄连碱、药根碱、表木兰碱等，其中以小檗碱含量最高，可达10%左右，且以盐酸盐的状态存在于黄连中。小檗碱盐酸对痢疾杆菌、葡萄球菌和链球菌等均有显著抑制作用，临床用于治疗细菌性痢疾和胃肠炎等，无耐药性和副作用。 一、 实验目的：
1、掌握盐酸小檗碱的一种提取方法，熟悉盐析法、重结晶法。 2、掌握小檗碱的结构特点，特殊的理化性质和薄层鉴定方法。 3、通过实验熟悉和掌握柱层析法的分离原理及操作技能。 二、 小檗碱的结构及性质
小檗碱为黄色长针状结晶，具5.5个结晶水，m.p145℃，能缓缓溶于冷水中（1：20），微溶于冷乙醇（1：100），易溶于热水和热乙醇，微溶或不溶于苯、氯仿和丙酮，与酸结合成盐时失去一分子水，其硝酸盐和氢碘酸盐极难溶于水，盐酸盐微溶于冷水，较易溶于沸水，其硫酸盐，构椽酸盐在水中溶解度较大。盐酸小檗碱为黄色结晶，含2分子结晶水，220℃左右分解为棕红色小檗红碱，285℃左右完全溶融，UVλmax265nm，343nm。游离小檗碱易和1分子丙酮或1分子氯仿或1.5分子苯结合成一黄色络合物晶体。 三、 实验原理
本实验利用小檗碱与含氧酸（硝酸例外）所成盐在水中溶解度较大的性质，采用稀硫酸将其以硫酸盐形式提取出来，再根据小檗碱与氢卤酸所成盐在水中溶解度较小的特点，在将小檗碱游离后，加入盐酸使其形成盐酸盐，结合成盐析法，使之沉淀析出。 四、 实验内容 1、提取
取黄连粗粉25克，加入0.2%H2SO4液200ml加热煎煮1小时（注意随时补充蒸发损失的溶剂），纱布过滤，残渣再加0.2%H2SO4液200ml 加热煎煮45分钟，纱布过滤，两次滤液合并。向滤液中加入石灰乳调节pH12，抽滤，再向抽滤所得的滤液中滴加浓HCl，调节pH2-3，然后加入8%（W/V）氯化钠，搅拌并使完全溶解，并继续搅拌至溶液出现微浊现象为止，放置过夜。则有盐酸小檗碱沉淀析出。
2、分离及精制
抽滤，得盐酸小檗碱粗品，水洗，加适量蒸馏水加热溶解，趁热抽滤，滤液
放置，则有盐酸小檗碱结晶析出。再进行重结晶：即滤取结晶，加入适量乙醇，水浴加热溶解，趁热抽滤，滤液放置结晶。待盐酸小檗碱析出完全后，滤出，80℃干燥，得成品。 3、盐酸小檗碱的检识
（1）取盐酸小檗碱少许，加10%稀硫酸适量使之溶解后，加入一点漂白粉，即显樱红色。
（2）取盐酸小檗碱少许，加热使其溶于水中，加10%NAOH使呈强碱性，然后滴加丙酮数滴，可见有黄色结晶性的小檗碱丙酮加成物生成。 4、柱层析分离
吸附剂：12克氧化铝（80-100目）
层析柱：1х40cm玻璃柱（也可用碱式滴定管代替） 洗脱剂：95%乙醇
（1）氧化铝吸附柱的制备（湿法装柱）
取一根25cm碱式滴定管代作层析管用，管的下端套一段约3-4cm长的乳胶管，在乳胶管上夹一螺旋夹，以控制洗脱液流出速度。在层析管的下端填一层松紧合适平整的脱脂棉。将此层析管垂直地固定在铁架台上，关闭螺旋夹。
管内先加入一定体积的洗脱剂（此处用95%乙醇），打开螺旋夹，放出管内乙醇，将层析管下端的脱脂棉内的空气充分赶尽，然后再向层析管中加入一定体积的乙醇。
取中性氧化铝（100-200目）12克于烧杯中，加一定体积的乙醇调成浆状，赶尽其中气泡，然后通过小玻璃漏斗将浆状氧化铝徐徐注入注中，并同时打开下端螺旋夹，让洗脱剂缓缓流出，不断用手轻轻振动玻璃柱，使氧化铝沉降均匀。当柱内液面接近氧化铝柱面时，关闭螺旋夹。 （2） 样品的加入
称取50-100mg盐酸小檗碱，加少量95%乙醇于水浴上加热溶解，用滴管沿层析管壁小心加入，勿使氧化铝柱面受到振动。找开螺旋夹，当液体表面下降接触氧化铝时，关闭螺旋夹。 （3）洗脱
用滴管吸取95%乙醇，经管壁轻轻加入柱内，打开螺旋夹，控制流速20-30滴/分钟，不断加入洗脱剂，使洗脱剂的液面始终高于氧化铝。待氧化铝柱上呈现数段不同颜色的色带时，继续冲洗，使其彼此分离，并收集鲜黄色带，此段为盐酸小檗碱，其余色带为其它成分。 5、薄层层析鉴定 薄层板：硅胶G-CMC板
样品：实验所得精制盐酸小檗碱的醇溶液
对照品：1%盐酸小檗碱的醇溶液
展开剂：氯仿：甲醇=7：2，氨水饱和20分钟 展距：10cm 显色：自然光下观察 结果：计算Rf值
五、实验说明及注意事项
1、整个操作过程，氧化铝柱表面应保持一定高度的溶剂（洗脱剂），不得使柱面溶剂流干。
2、一般采用等量收集洗脱液流份。每份洗脱剂体积的毫升数，一般与吸附剂重量相近。如果洗脱剂极性较大或样品各组份结构相近似时，每份收集量要小； 3、洗脱时流速不宜过快，太快时柱中交换来不及达到平衡，影响分离效果； 4、由于氧化铝表面活性较大，有时会促使某些成分发生变化，应在短时间内完成一个柱层析的分离，以免样品在柱上起异构化、氧化、皂化、水合以及脱氢形成双键等反应。样品在柱上会扩散也会影响分离效果。
5、氧化铝的粒度一般为100-200目，用量一般为样品量的20-50倍，根据被分离的化合物而定，有时可达100-200倍。硅胶吸附柱层析粒度一般为100-160目或160目以上，用量为样品量的30-60倍，较难分离的化合物可选用500-1000倍。
六、思考题
1、采用柱层析分离时应注意哪些方面的问题？ 2、为什么本实验采用氧化铝而不采用硅胶作吸附剂？
实验三 槐花米中芦丁的提取、分离与鉴定
芦丁（Rutin）广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物至少在70种以上，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有。尤以槐花米（为植物Sophora japonica的未开放的花蕾）和荞麦中含量最高，可作为大量提取芦丁的原料。槐花米为豆科植物槐花的未开放花蕾。味苦性凉，具清热、凉血、止血之功。槐花的主要化学成分为芦丁，又名芸香甙，含量可达12-16%。
芦丁是由槲皮素（Quercetin）3位上的羟基与芸香糖（Rutinose）〔为葡萄糖（Glucose）与鼠李糖（Rhamnose）组成的双糖〕脱水合成的苷。为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水，熔点为174~178℃，无水物188~190℃。溶解度：冷水中为1:10000；热水中1:200；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。 芦丁具有维生素P样作用。可降低毛细管前壁的脆性和调节渗透性，有助于保持及恢复毛细血管的正常弹性，临床上用作毛细管脆性引起的出血症，并常用作防治高血压病的辅助治疗剂。现在国处也常用芦丁作食品及饮料的染色剂。 一、实验目的
1．通过芦丁的提取与精制掌握碱-酸法提取黄酮类化合物的原理及操作。 2．掌握芦丁的一种提取、精制方法及提制过程中防止甙水解的方法。 3. 掌握黄酮甙水解生成甙元的方法及二者之间的分离。 4．熟悉芦丁、槲皮素的结构性质、检识方法和纸层析鉴定方法。 二、实验原理
本实验主要是利用芦丁中含有较多的酚羟基，可溶于碱中，加酸酸化后又可析出芦丁结晶的性质，采用碱溶酸沉法提取，并用芦丁对冷、热水的溶解度相差悬殊的特性进行精制。芦丁可被稀酸水解，生成槲皮素及葡萄糖、李糖，并能通过纸层析鉴定。芦丁及槲皮素还可通过化学反应及紫外光谱鉴定。 三、实验材料
槐米、活性炭、石灰乳、0.4％硼砂水溶液、2％的硫酸溶液、浓盐酸、正丁醇、冰醋酸、蒸馏水、1％的氢氧化钠溶液、1％的三氯化铝乙醇溶液、1％槲皮素乙醇溶液、95％乙醇、广泛pH试纸、中速层析滤纸等。 四、实验内容 （一）提取：
称取槐米30g，在乳钵中研碎后，投入300ml0.4％硼砂溶液的沸水溶液中煮沸2-3分钟，在搅拌下加入石灰乳调pH9，煮沸40分钟（注意添加水，保持原有体积，保持pH8~9），趁热倾出上清液，用棉花过滤（或用四层纱布过滤）。残渣加100ml水，加石灰乳调pH9，煮沸30分钟，趁热用棉花过滤（或用四层纱布过滤），二次滤液合并。滤液保持在60℃，加浓HCl，调pH2-3，放置过夜，待析出结晶，
天然药物化学实验讲义汇总
