BugBusterMasterMix预混蛋白抽提试剂抽提可溶蛋白

BugBuster Master Mix预混蛋白抽提试剂抽提可溶

蛋白

1. 用经预先称重的离心管10,000g离心10分钟从液体培养体系收集细胞。如果是小规模培养(如1.5ml或更少),可以用1.5ml离心管14,000–16,000g离心。尽量倾去液体,称量细胞沉淀湿重。

2. 室温下用吸打或温和涡旋使BugBuster Master Mix与细胞沉淀混匀,每克细胞糊需要5ml抽提试剂。

这相当于50ml培养液采用2.5ml抽提试剂。如果是小规模培养,则采用约1/5培养体积的抽提试剂重悬

沉淀(例如,1.5ml培养液采用300μl抽提试剂)。如果抽提试剂过量也没有什么副作用。

选做:加蛋白酶抑制剂。BugBuster Master Mix与蛋白酶抑制剂兼容。如果目的蛋白后续要用凝血酶

(货号69671),Xa因子(货号69036)或重组肠激酶(货号69066)处理,就应该避免使用丝氨酸蛋

白酶抑制剂。尽管纯化过程可能去除活性抑制剂,建议在酶切前最好做透析或凝胶过滤。

3. 室温下将重悬的细胞液在摇板或低速转动搅拌器上孵育10-20分钟。

注意:孵育后获得的抽提物不是粘稠的。

4. 4℃下16,000g离心20分钟以去除不溶的细胞碎片。如果需要,沉淀可以留作“包涵体纯化”(见以

下说明)的材料。

5. 将上清转入另一个新试管。这样抽提得到的可溶蛋白溶液可以直接上样于Novagen的纯化树脂(以

及其它很多类似纯化系统)。蛋白溶液在冰上可以短时存放(2-3小时),也可在-20℃长时间存放直至

下步分析。蛋白抽提液应该根据目的蛋白的活性要求的温度存放,有些蛋白经冻融会失活。