Galectin-3在缺血性心功能不全家兔心室重构中的作用 

Galectin-3在缺血性心功能不全家兔心室重构中的作用

张跃华， 李树仁△， 邓文浩， 郝 潇， 李 沙， 马玉龙， 杨玲玲

【摘 要】[摘 要] 目的： 探讨半乳糖凝集素3(galectin-3，Gal-3)与心肌纤维化的关系，明确Gal-3在缺血性心功能不全家兔心室重构中的作用。方法: 采用结扎冠状动脉前降支的方法制作缺血性心功能障碍家兔模型。利用随机数字表法将20 只家兔随机分为假手术组和心功能不全组。造模成功4周后采用心脏超声测定心功能；real-time PCR和Western blot方法分别检测心肌中Gal-3、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的 mRNA 表达和蛋白含量；ELISA法检测家兔血清中Gal-3水平；采用HE染色和Masson染色法检测家兔梗死区心肌组织的纤维化程度。结果: 与假手术组相比，心功能不全组梗死区心肌组织Gal-3的mRNA和蛋白表达明显增加，与此同时Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的mRNA和蛋白表达也明显增加；血清Gal-3水平明显上升；病理学观察可见心功能不全组的心肌细胞形态不一、排列紊乱，纤维组织明显增生。结论: Gal-3加重了缺血性心功能不全家兔的心肌纤维化，促进了心室重构和心衰的发生。

【期刊名称】中国病理生理杂志【年(卷),期】2017(033)007【总页数】5

【关键词】[关键词] 半乳糖凝集素3； 心力衰竭； 心肌梗死； 心室重构； 心功能不全

心力衰竭是一种复杂的临床症候群，是各种心血管疾病的严重阶段。心室重构被认为是心衰发展的基础，已有在众多基础实验和临床实验研究表明，心室结构重构在心衰的发生与发展中起着关键作用。心室结构重构包括心室的大小、形态和组织结构的改变，心脏结构和功能的改变往往早于患者出现相应的临床症状[1]。近年来，减慢或延缓心室重构的进展成为治疗心衰的主要方向，然而心衰的心室结构重构分子机制尚未明确。半乳糖凝集素3(galectin-3，Gal-3)是巨噬细胞分泌的一种β-半乳糖苷激素，是一种强大的炎症信号分子，参与调节细胞黏附、活化和趋化，参与免疫应答，调节细胞生长及凋亡等过程[2] 。近期已有众多研究表明Gal-3在众多心血管疾病中也起着重要作用[3-5]，它参与心室重构和心衰的病理过程并且对心衰的预后有预测作用。目前国内对Gal-3与心衰和心室重构的关系尚不完全明确。本研究通过检测Gal-3在缺血性心功能不全家兔中的表达，探讨Gal-3与心肌纤维化的关系，明确Gal-3在缺血心功能不全心室重构中的作用，为心衰的临床治疗提供基础支持。

材 料 和 方 法

1 实验动物

本实验选用健康 3 月龄新西兰雄性家兔(合格证号为1606173)共 20只，体重约2.5 kg，由河北医科大学实验动物中心提供。

2 主要实验仪器及试剂

心脏超声仪(TOSHIBA)；低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；QL-902涡旋振荡仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific)；LineGene 9600 Plus荧光定量PCR仪(Bioer Technology)；兔血清Gal-3 ELISA试剂盒(上海蓝基科技公司)；HiFiMMLV cDNA第一链合成试剂盒、UltraSYBR Mixture (With ROX)和5×RNA loading buffer(北京康为世纪生物科技有限公司)；载玻片(海门市世态实验器材制造公司)；分析纯二甲苯(兆京化工厂)；苏木素和0.5%伊红(Sigma)。3 方法

3.1 动物的分组及处理 按照随机数字表法将20只家兔分为心功能不全组和假手术组各10只，采用开胸结扎冠状动脉法制备心功能不全模型。

3.2 实验动物模型制备 心功能不全组采用结扎前降支的方法制作心功能障碍模型。记录术前心电图后开胸结扎冠状动脉前降支，模型制备成功标准为心尖部及左室前壁由红色变为暗紫色，局部心肌运动异常，心电图示胸前导联 ST 段持续弓背向上抬高[6]。假手术组只开胸不结扎冠状动脉前降支，模型制备后心尖部及左室前壁没有颜色变化，心肌运动无异常，心电图示胸前导联 ST 段未抬高。2组术后每天肌注青霉素8×105 U，共3 d。

3.3 超声心动图检测心功能 术前、术后2 周及术后4周由同一专科医生行超声心动图检查，测量2组左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)和左室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)。所有测量值均取3 次测量的平均值。

3.4 Real-time PCR 法检测梗死区心肌组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及Gal-3的mRNA表达 造模后4 周，取50 mg 心肌梗死区域心肌组织进行研磨，提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳测其完整性; 按照反转录试剂盒说明书进行反转录，反应条件为： 42 ℃ 50 min， 95 ℃ 5 min。β-actin 的上游引物为5’-AGATCGTGCGGGACATCAAG-3’，下游引物为5’-CAGGAAGGAGGGCTGGAAGA-3’，扩增产物为182 bp；Ⅰ型胶原的上游引物为5’-TGAGCCAGCAGATTGAGAACAT-3’，下游引物为5’-TGTCGCAGAAG ACCTTGATGG-3’，扩增产物为165 bp；Ⅲ型胶原的上游引物为5’-GTACAACTAGCATTCCTCCGACTG-3’，下游引物为5’-TTAGAGCAGCCATCCTCCAGAAC-3’，扩增产物为203 bp; Gal-3的上游引物为5’-CTGTGCCTTATGACCTGCCTCT-3’，下游引物为5’-TCATTGACCGCAACCTTGAAGTG-3’，扩增产物为301 bp。将获得的cDNA 按照实时荧光定量PCR 试剂盒操作说明书方法扩增目的基因，PCR 热循环参数为： 96 ℃ 4 min； 95 ℃ 10 min， 95 ℃ 15 s， 60 ℃ 60 s， 45 个循环。以β-actin为内参照，将目的基因表达的相对定量值用于统计学分析。Real-time PCR 采用2-ΔΔCt法计算结果[7]。将所得的Gal-3的mRNA表达量与LVEF 进行相关分析。

3.5 Western blot法检测梗死区心肌组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及Gal-3的蛋白含量 将梗死区的心肌组织称重后研磨提取组织中的蛋白，根据目的蛋白的分子量，配制8%、12%的分离胶和5%浓缩

胶，进行丙烯酰胺凝胶电泳，然后湿转膜，孵育相应Ⅰ、Ⅱ抗，ECL发光反应检测并分析目的蛋白含量。将所得的Gal-3蛋白量与LVEF 进行相关性分析。

3.6 ELISA法检测血清中Gal-3的含量 分别在术前、术后2周和术后4周，经家兔耳中动脉取血，离心15 min 后取上清，按照ELISA 试剂盒说明书进行操作；依据标准品浓度及其吸光度(A)计算相应公式，依据公式和样品A值计算样品Gal-3 的浓度，然后将所得的血清Gal-3 的浓度与LVEF 进行相关分析。

3.7 组织病理观察 采用HE染色和Masson染色法观察家兔梗死区心肌组织纤维化程度。4 统计学处理

使用 SPSS 21.0软件包进行数据处理，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间均数比较采用两独立样本t检验。相关变量间采用直线相关分析。以 P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 心肌梗死后心功能障碍模型结果

20只新西兰雄性家兔在造模后共有16 只存活，其中心功能不全组存活 8只，死亡2只，因结扎前降支的过程中诱发室颤而死亡；假手术组存活8只，死亡2只，其中1只于手术过程中大出血死亡，另1只开胸过程中发生气胸而死亡。2 超声心动图检查结果

对造模前心功能不全组和假手术组的超声结果行两独立样本t检验，结果显示LVEF和LVEDD差异无统计学显著性，说明2组家兔在造模前的心功能是一致的。

对造模后2周和4周的心功能不全组和假手术组的超声结果行两独立样本t检验，结果显示LVEF和LVEDD差异有统计学意义(P<0.05)。与假手术组相比，心功能不全组LVEF明显下降，LVEDD明显增大，见表1。

3 梗死区心肌组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及Gal-3的mRNA表达

与假手术组相比，心功能不全组梗死区心肌组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及Gal-3的mRNA表达明显增加。Gal-3的mRNA水平与LVEF存在负相关关系(r =-0.923， P<0.05)，见表2。4 梗死区心肌组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及Gal-3的蛋白含量

Western blot的检测结果表明，与假手术组相比，心功能不全组梗死区心肌组织中Gal-3、Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原的蛋白含量显著增加。Gal-3的蛋白含量与LVEF存在负相关关系(r=-0.909，P<0.05)，见图1、表3。5 血清Gal-3的含量

对心功能不全组和假手术组术前血清中Gal-3的浓度进行两独立样本t检验，差异无统计学显著性。分别对2组术后2周和4周血清中Gal-3的浓度进行t检验，结果显示2组差异有统计学意义(P<0.05)。与假手术组相比，术后2周到4周血清Gal-3的含量逐渐增加。血清Gal-3的浓度与LVEF存在负相关关系(r=-0.89， P<0.05)，见表4。*P<0.05 vs sham operation group.6 病理组织结果

假手术组和心功能不全组心梗区心肌组织，经石蜡包埋切片、Masson染色和HE染色。HE染色后于光镜下观察，可见假手术组心肌细胞形态均一、排列整齐。细胞质染色均匀，呈淡红色，胞核大小一致，呈椭圆形或圆形，居胞质中央；心功能不全组心肌细胞形态大小不一、排列紊乱，细胞质染色不均匀呈散点状，细胞核消失或呈梭型。Masson染色镜下可见假手术组心肌细胞形态均一，红色心肌细胞染色均匀，蓝色纤维组织较少，心功能不全组梗死区心肌细胞形态消失，取而代之的是成纤维细胞及粗大的胶原纤维束，排列疏松，见图2。

讨 论

近代人们通过对心衰的心脏结构与功能改变长期研究，Baumbach等[8]于1989年首次提出心室重构这个概念。心室重构一直被认为是心衰发展的基础，是心衰患者发病率和死亡率的决定因素，所以减慢或延缓心室重构的进展也成为治疗心衰的主要方向，然而心室重构分子机制还尚未明确。纵观近几年研究发现Gal-3与心室重构的关系备受关注，目前已有众多文章表明Gal-3很可能是参与心室重构的一个分子机制。Kortekaas等[9]研究了Gal-3与左室重构的关系。研究证明Gal-3高水平与逆转左室重构有关。Lok等[10]的研究显示，在严重慢性心衰患者中Gal-3和左室重构有关，并能预测远期死亡率。

本研究通过病理图片可以从组织结构上看出与假手术组相比，心功能不全组心肌细胞形态不一、排列紊乱，纤维组织增生明显。 Real-time PCR 结果表明与假手术组相比，心功能不全组梗死区心肌组织Gal-3的mRNA表达明显增加，与此同时Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及Ⅰ型胶原/Ⅲ型胶原比值也明显增加。由此可以说明心功能不全组家兔心肌组织中，心肌间质胶原蛋白沉积，Ⅰ型胶原升高更明显。Gal-3的mRNA表达水平与LVEF做相关性分析结果显示，Gal-3与LVEF存在负相关，且为强相关，这就表明随着Gal-3水平的升高，心功能在逐渐下降。Western blot实验结果表明与假手术组相比，心功能不全组梗死区心肌组织中Gal-3、Ⅰ型胶原及Ⅲ型胶原的蛋白含量显著增加。Gal-3的蛋白含量与LVEF做相关性分析结果显示，Gal-3与LVEF存在负相关关系。与假手术组相比，心功能不全组造模后4周血清Gal-3的含量明显增加且与LVEF呈负相关关系，这就表明随着血清Gal-3水平的升高心功能在逐渐下降，这也将为Gal-3成为心衰指标提供了依据。上述结果与病理组织结构改变是一致的。由此可见随着Gal-3水平的升高，Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达增加，心肌胶原网的构架改变，心肌纤维化加重，促进了心室肥厚和心室重构过程，促进了心功能下降和心衰的发生。心室重构是引起心力衰竭的重要病理生理机制之一，被认为是心衰发展的基础，是心衰患者发病率

和死亡率的决定因素，所以减慢或延缓心室重构的进展成为治疗心衰的主要方向。本研究已证实Gal-3促进了心肌纤维化，参与了心室重构过程，故可能成为心衰治疗的一个新靶点。Gal-3相关抑制剂可能会给减慢或逆转心室重构和心衰的治疗注入新力量，但Gal-3能否真正成为心衰治疗的靶点，其抑制剂能否逆转心室重构、改善患者预后均有待于进一步研究。[参 考 文 献]

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doi：10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.012杂志网址： http://www.cjpp.net

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