流式细胞仪操作规程目录
1：淋巴细胞亚群测定及绝对计数
2：活化淋巴细胞亚群、记忆T及纯真T的检测 3：HLA-B27测定 4：CD55／CD59测定 5：干细胞检测和绝对计数 6：白血病免疫分型测定
7：淋巴细胞T细胞亚群细胞内因子IFN-γ/IL-4测定 8：细胞周期分析 9：活化血小板检测 10：血小板抗体测定 11：红细胞抗体测定 12：粒细胞抗体测定
淋巴细胞亚群测定
(流式细胞仪) 医院检验科 操作规程文件号： 200 年 月 日起实施
第1版 (共3页)
本规程每
2年复审一次
复审日期： 年 月 日 复审人： 规程编写者： 审 批 者： 批准日期： 年 月 日 文件分发部门和／或个人 院档案室保管者： 检验科 主任： 检验科 实验室：
淋巴细胞亚群测定
方法 流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特) 原理： 双/三色/四色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与白细胞膜上相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到淋巴细胞亚群的百分数，加入Flow-Count即可得出绝对计数。淋巴细胞表面抗原分布如下：T淋巴细胞：CD3+；B淋巴细胞：CD3-，CDl9+；辅助性T淋巴细胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴细胞：CD3+CD8+；NK细胞：CD3-CDl6+56+等。根据淋巴细胞膜上CD分子表达的不同，流式细胞仪可以分辨出淋巴细胞及其各种不同的亚群，利用计算机软件计算出淋巴细胞亚群的百分数，加入Flow-Count组会自动得出绝对计数。 标本采集与处理 受检者的准备 检查对象生活饮食处于日常状态。 采集部位 静脉采血 抗凝剂 EDTA或肝素抗凝血 要求 1．样本量1ml。 2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻或溶血的标本不能用。 3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L， 样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。 试剂 品牌 剂型 规格 贮存 贝克曼库尔特 成分 1：单克隆抗体 液体 2—8℃ (CD45/4/8/3 No.6607013 CD45/56/19/3 No.6607073 CD4/8/3 No.IM1650 同型对照IgG1/IgG1/IgG1 No.IM1672 CD3/19 No.IM1293 CD3/16+56 No.IM2076 CD19-PC5 No.IM2643 Flow-Count荧光微球 No.7547053) 2：全血溶血试剂(Q-Prep) 液体(No.7546946) A：甲酸 液体 70ML 室温 B：碳酸钠等 液体 32ML 室温 C：多聚甲醛 液体 14ML 室温 (Optilyse C No.IM1401) 液体 室温 3：鞘液(No.8546859) 液体 20L 室温 4：清洗液(No.8546930) 液体 5L 室温 5：荧光微球(No.6605359) 液体 10ML 2-8℃(Flow-Check) 仪器 BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra 样本制备： 1)按照要求，分别向已编好号的试管中加入10/20 ul单克隆抗体和同型对照 2)分别向试管中加入混匀的100u1抗凝血。 3)混匀，避光，室温孵育20-30分钟 4)溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血) b. 使用COULTER Q—PREP制备系统 开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。 （*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体） 5)上机测样（可根据样本情况选择洗或不洗上样） 6)需要做绝对计数的指标，在相应管中加入与血样等量的Flow-Count(务必做到三同：同枪，同人，同种方法加Flow-Count，而且加完即上机) 报告结果 报告百分数（和绝对值） 操作性能 精密度 批内五次重复CV<2％ 参考值(百分数（绝对值）) CD3+ 60.8-75.4%(1141-1880) CD4+ 29.4-45.8%(478-1072) CD8+ 18.2-32.8%(393-742) NK 9.5-23.5% (175-567) Th/Ts 1.05-2.03 临床意义 1.T、B淋巴细胞亚群是重要的免疫状态检测指标，在肿瘤、免疫缺陷、病毒感染，自身免疫性疾病、创伤、急性感染、多脏器功能衰竭、器官移植等具有临床诊断、病情判断、治疗等价值。 临床常用Th／Ts比值来判断病人的免疫状况。 Th／Ts比值升高：表示免疫功能亢进：见于自身免疫性疾病，如SLE、类风湿性关节炎、自身免疫性溶血性贫血、重症肌无力以及HBsAg+乙肝等。 Th／Ts比值减低：表示免疫功能下降：艾滋病、病毒感染、肿瘤病人、慢活肝和活动性肝硬化、再生障碍性贫血、粒细胞减少患者。 2：NK细胞主要破坏各种肿瘤细胞和感染某些病毒、细菌的细胞，所以在抗肿瘤和防御疾病中起主要作用。NK活性减低主要见于各种恶性肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染、应用免疫抑制剂，疲劳综合征病人等，NK活性随年龄增长而减退。NK细胞也参与第二型超敏反应和移植物抗宿反应，白介素-2治疗后；外周血NK细胞增加。 方案（Protocol） 1.选参数 点击 点击
流式细胞仪操作规程-SOP
