基于抗氧化的大豆异黄酮对PC12细胞的神经保护作用
徐梦蕾1，高 宇2，刘静波1，熊晋锋3，赵颂宁1，黄延军1
【摘 要】实验研究了20.00 μg/mL的单一染料木黄酮(GEN)、大豆黄素(DAI)及其混合溶液(GEN-DAI)对PC12细胞的存活率、形态、线粒体膜电位以及超氧化物歧化酶活力和抑制率的影响。结果表明：3种溶液对上述指标均没有显著影响，但GEN提高了活性氧水平，相对荧光强度和丙二醛含量有所升高；DAI和GEN-DAI溶液显著地降低了乳酸脱氢酶漏出率，谷胱甘肽含量分别增加到(297.27±9.47) μmol/(g·prot)、(269.90±0.00) μmol/(g·prot)；GEN-DAI混合溶液综合增强了胆碱系统的代谢，提高了乙酰胆碱含量。GEN-DAI混合溶液比两种单一组分溶液能够更有效地提高PC12细胞抗氧化系统活力。 【期刊名称】吉林大学学报（工学版） 【年(卷),期】2017(047)001 【总页数】5
【关键词】食品加工技术；PC12细胞；大豆异黄酮；抗氧化；神经保护作用；染料木黄酮；大豆黄素
0 引 言
大豆异黄酮是豆科植物的一类植物次生代谢物，主要贮存在液泡或者细胞壁中[1]。已经发现的大豆异黄酮有15种，染料木黄酮(Genistein，GEN，又称染料木素、金雀异黄素)和大豆黄素(Daidzein，DAI，又称黄豆黄素-I、大豆苷元)在大豆籽粒中占80%～95%[2]。它们以游离型(苷元)、葡萄糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型、丙二酰基葡萄糖苷和琥珀酰苷5种形式存在，其中以葡萄糖苷型和丙二酰基葡萄糖苷两种形式居多，琥珀酰形式在大豆的发酵形式——纳豆中发
现[3]。
大豆异黄酮在神经保护作用上的研究成为热点。GEN在蒙古沙鼠脑模型中有很强的神经保护作用[4]。在胚胎鼠原代皮层神经元类似缺血性的损伤中，GEN可以有效地阻止β-淀粉样蛋白引起的炎症反应，达到保护神经的作用[5]。DAI也有神经保护的作用，并且可以减少缺血及再灌注导致的损伤[6]。这些研究都是针对单一的成分进行的，但实际上，往往混合的成分有更好的功能性，使实验结果完全不同。动物实验中DAI和GEN的混合物(含量同豆粉中的比例相同)会加快乳腺肿瘤的生长；豆粉却有抑制肿瘤的作用[7]。这些都说明各组分在联合时产生的作用可能完全不同于单个物质本身，使整体具有部分所不具有的功能性。目前，很少有文献报道不同大豆异黄酮对神经细胞的作用，因此有必要研究大豆异黄酮单独组分及其混合物对神经细胞的作用。
PC12细胞是一种来自大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤的克隆细胞系，作为类神经元细胞，经常用于多巴胺能的神经细胞模型以及神经系统疾病的体外研究[8]。本文以PC12细胞作为神经细胞模型，研究了GEN、DAI及其混合溶液对PC12细胞的影响。从细胞形态、数量、抗氧化防御系统(包括抗氧化酶及非酶抗氧化物质)、培养液中乙酰胆碱(ACh)含量以及线粒体膜电位变化等方面，探讨了不同大豆异黄酮溶液对PC12细胞的作用机理。
1 材料与方法
1.1 原料
实验室自有大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤(PC12细胞)；染料木黄酮(GEN，质量分数为99%)、大豆黄素(DAI，质量分数为99%)、2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA，质量分数为97%)和二甲基亚砜(DMSO，质量分数为99%)购自
Sigma-Aldrich公司；DMEM-低糖培养基、胎牛血清(FBS)、磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)和质量分数为0.25íTA型胰酶购自美国Gibco公司；MTS单溶液细胞增殖检测试剂盒购自美国Promega公司；青霉素链霉素溶液(双抗)购自美国HyClone公司；乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒、总谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)和BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天公司；超氧化物歧化酶(SOD)WST-1法试剂盒购自南京建成生物工程研究所。 1.2 仪器和设备
主要仪器和设备有AG-204型电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)、DW-86L288型超低温保存箱(青岛海尔股份有限公司)、Bio Tek Synergy HT型多功能酶标仪(美国博腾仪器有限公司)、BDS-300倒置生物显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司)、FV1000型激光共聚焦扫描显微镜(日本OLYMPUS公司)。 1.3 试验方法 1.3.1 试剂配制方法
GEN、DAI粉末溶于DMSO中，用蒸馏水稀释，使DMSO质量分数小于0.1%，保存于4 ℃冰箱备用。DCFH-DA粉末溶于DMSO中，摩尔浓度为10 mM/L，贮存于-20 ℃备用，使用前用DMEM稀释[9]。 1.3.2 细胞培养、形态观察及存活率计算方法
将PC12细胞(1×105 个/mL，800 μL/孔)种入24孔板，37 ℃恒温培养24 h后分别暴露于200 μL/孔GEN溶液、DAI溶液、GEN-DAI混合溶液(质量浓度均为20.00 μg/mL)，其中阳性对照组质量浓度为0.00 μg/mL；再培养24 h后用显微镜观察形态。细胞数量的测定方法为培养结束后加入200 μL/孔MTS
基于抗氧化的大豆异黄酮对PC12细胞的神经保护作用
