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2.2 GC含量分布检查
GC含量分布检查用于检测有无AT、GC 分离现象，而这种现象可能是测序或者建库所带来的，并且会影响后续的定量分析。
在illumina测序平台的转录组测序中，反转录成cDNA时所用的6bp 的随机引物会引起前几个位置的核苷酸组成存在一定的偏好性。而这种偏好性与测序的物种和实验室环境无关，但会影响转录组测序的均一化程度(Hansen et al.)。除此之外，理论上G和C碱基及A和T碱基含量每个测序循环上应分别相等，且整个测序过程稳定不变，呈水平线。对于DGE测序来说，由于随机引物扩增偏差等原因，常常会导致在测序得到的每个read前6-7个碱基有较大的波动，这种波动属于正常情况。
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图2.2 GC含量分布图
横坐标为reads的碱基位置，纵坐标为单碱基所占的比例；不同颜色代表不同的碱基类
型
2.3 测序数据过滤
测序得到的原始测序序列，里面含有带接头的、低质量的reads，为了保证信息分析质量，必须对raw reads进行过滤，得到clean reads，后续分析都基于clean reads。
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数据处理的步骤如下：
(1) 去除带接头(adapter)的reads；
(2) 去除N(N表示无法确定碱基信息)的比例大于10%的reads； (3) 去除低质量reads。
RNA-seq 的接头(Adapter, Oligonucleotide sequences for TruSeqTM RNA and DNA Sample Prep Kits) 信息：
RNA 5’ Adapter (RA5), part # 15013205：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’
RNA 3’ Adapter (RA3), part # 15013207：
5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(6位index)ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’
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图2.3 原始数据过滤结果
2.4 测序数据质量情况汇总
表2.4 数据产出质量情况一览表
Sample name Clean reads clean bases 可编辑
Raw reads Error rate(%) Q20(%) Q30(%) GC content(%) 精品文档
HS1_1 HS1_2 HS2_1 36579608 35175205 36579608 35175205 36547734 35119463 3.52G 3.52G 3.51G 0.03 0.03 0.03 97.88 92.88 96.50 90.38 97.85 92.81 49.39 49.59 49.53 数据质量情况详细内容如下：
(1) Raw reads：统计原始序列数据，以四行为一个单位，统计每个文件的测序序列的个数。
(2) Clean reads：计算方法同 Raw Reads，只是统计的文件为过滤后的测序数据。后续的生物信息分析都是基于Clean reads。
(3) Clean bases：测序序列的个数乘以测序序列的长度，并转化为以G为单位。
(4) Error rate：通过公式1计算得到。
(5) Q20、Q30：分别计算 Phred 数值大于20、30的碱基占总体碱基的百分比。
(6) GC content：计算碱基G和C的数量总和占总的碱基数量的百分比。
3 参考序列比对分析
测序序列定位算法：根据不同的基因组的特征，我们选取相对合适的软件(动植物用TopHat(Trapnell et al., 2009)、真菌或者基因密度较高的物种用Bowtie)，合适的参数设置(如最大的内含子长度，会根据已知的该物种的基因模型来进行统计分析)，将过滤后的测序序列进行基因组定位分析。下图为TopHat
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有参考基因组的转录组生物信息分析模板
