有参考基因组的转录组生物信息分析模板

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一、生物信息分析流程

获得原始测序序列(Sequenced Reads)后，在有相关物种参考序列或参考基因组的情况下，通过如下流程进行生物信息分析：

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二、项目结果说明

1 原始序列数据

高通量测序(如illumina HiSeqTM2000/MiSeq等测序平台)测序得到的原始图像数据文件经碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列

(Sequenced Reads)，我们称之为Raw Data或Raw Reads，结果以FASTQ(简称为fq)文件格式存储，其中包含测序序列(reads)的序列信息以及其对应的测序质量信息。

FASTQ格式文件中每个read由四行描述，如下：

@EAS139:136:FC706VJ:2:2104:15343:197393 1:Y:18:ATCACG

GCTCTTTGCCCTTCTCGTCGAAAATTGTCTCCTCATTCGAAACTTCTCTGT +

@@CFFFDEHHHHFIJJJ@FHGIIIEHIIJBHHHIJJEGIIJJIGHIGHCCF

其中第一行以“@”开头，随后为illumina 测序标识符(Sequence Identifiers)和描述文字(选择性部分)；第二行是碱基序列；第三行以“+”开头，随后为illumina 测序标识符(选择性部分)；第四行是对应序列的测序质量(Cock et al.)。

illumina 测序标识符详细信息如下：

EAS139 136 FC706VJ 2 2104 Unique instrument name Run ID Flowcell ID Flowcell lane Tile number within the flowcell lane 可编辑

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15343 197393 1 Y 18 ATCACG 'x'-coordinate of the cluster within the tile 'y'-coordinate of the cluster within the tile Member of a pair, 1 or 2 (paired-end or mate-pair reads only) Y if the read fails filter (read is bad), N otherwise 0 when none of the control bits are on, otherwise it is an even number Index sequence 第四行中每个字符对应的ASCII值减去33，即为对应第二行碱基的测序质量值。如果测序错误率用e表示，illumina HiSeqTM2000/MiSeq的碱基质量值用Qphred表示，则有下列关系：

公式一： Qphred = -10log10(e)

illumina Casava 1.8版本测序错误率与测序质量值简明对应关系如下：

测序错误率 5% 1% 0.1% 0.01% 测序质量值 13 20 30 40 对应字符 . 5 ? I

2 测序数据质量评估

2.1 测序错误率分布检查

每个碱基测序错误率是通过测序Phred数值(Phred score, Qphred)通过公式1转化得到，而Phred 数值是在碱基识别(Base Calling)过程中通过一种预测碱基判别发生错误概率模型计算得到的，对应关系如下表所显示：

illumina Casava 1.8版本碱基识别与Phred分值之间的简明对应关系

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Phred分值 10 20 30 40 不正确的碱基识别 1/10 1/100 1/1000 1/10000 碱基正确识别率 90% 99% 99.9% 99.99% Q-sorce Q10 Q20 Q30 Q40 测序错误率与碱基质量有关，受测序仪本身、测序试剂、样品等多个因素共同影响。对于RNA-seq技术，测序错误率分布具有两个特点：

(1)测序错误率会随着测序序列(Sequenced Reads)的长度的增加而升高，这是由于测序过程中化学试剂的消耗而导致的，并且为illumina高通量测序平台都具有的特征(Erlich and Mitra, 2008; Jiang et al.)。

(2)前6个碱基的位置也会发生较高的测序错误率，而这个长度也正好等于在RNA-seq建库过程中反转录所需要的随机引物的长度。所以推测前6个碱基测序错误率较高的原因为随机引物和RNA模版的不完全结合(Jiang et al.)。测序错误率分布检查用于检测在测序长度范围内，有无异常的碱基位置存在高错误率，比如中间位置的碱基测序错误率显著高于其他位置。一般情况下，每个碱基位置的测序错误率都应该低于0.5%。

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图2.1 测序错误率分布图

横坐标为reads的碱基位置，纵坐标为单碱基错误率

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