二代测序技术在法医学中的应用进展
张素华，边英男，赵 琪，李成涛 （司法部司法鉴定科学技术研究所 上海市法医学重点实验室 上海市司法鉴定专业技术服务平台，上海 200063）
【摘 要】摘 要：近几年二代测序（second generation sequencing，SGS）技术的快速发展，使其在通量增大、读长增加的同时测序成本大幅降低，给生物学领域带来了新的突破，也使法医遗传学进入了一个新的发展阶段。本文从测序技术在法医遗传学的应用历程展开，回顾了测序技术对法医学遗传标记检测的重要性。以已有相关法医学研究应用的Roche、Illumina和Life Technologies三大测序技术公司推出的二代测序技术平台为例，探讨其在法医遗传学中的应用现状及潜能。目前可依赖这些平台完成DNA水平遗传标记（SNP、STR）、RNA水平遗传标记（mRNA、microRNA）及线粒体DNA全基因组的测序。然而，技术产品的推出及验证、分析软件的成熟化、与现有数据库的对接、大数据使用中的伦理问题等都是决定该技术能否替代（或补充）成熟PCR毛细管电泳技术以及普遍应用于案件检测的关键。 【期刊名称】法医学杂志 【年(卷),期】2016(032)004 【总页数】9
【关键词】法医遗传学；二代测序；综述［文献类型］；遗传标记
1 测序技术在法医遗传学的应用历程
DNA测序技术在法医学中最早的应用是采用Sanger技术进行线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）高变区测序［1-3］。在20世纪80年代末至90年代初，法医学个人识别主要依赖限制性片段长度多态性（restriction
fragment length polymorphism，RFLP）遗传标记的检测，但是RFLP对DNA质量要求高，故无法对降解或微量的DNA样本（特别是骨DNA或者脱落毛发）提供有效的遗传信息［4-5］，因此，引发了对这部分DNA检材进行mtDNA高变区HVⅠ/HVⅡ的研究热潮。1999年，欧洲DNA分型组织（European DNA Profiling group，EDNAP）建立了mtDNA数据库（EMPOP）［6］，旨在为mtDNA测序建立一个通用的法医学标准，并提供mtDNA在线数据库，用于数据的查阅及比对。截至2013年10月16日，EMPOP中共包含34 617条来自全世界各地的线粒体序列信息，数据的获得主要依赖于传统的Sanger测序法（也称为双脱氧链末端终止法）。之后，连接有荧光标记基团的ddNTP和毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）技术的发展，在大大提高测序灵敏度和通量的同时测序成本大幅下降，使得对整个环状mtDNA测序变得可能。然而，受引物设计和测序通量的限制，该测序过程耗时长、成本高、结果分析繁琐，无法广泛应用于法医学生物检材的mtDNA全基因组测序。
随着CE技术的成熟和STR、SNP遗传标记在法医遗传学中的广泛应用，法医生物学领域对于mtDNA测序的需求逐步降低。Sanger技术在STR检测中主要用于等位基因的发现和确认；在SNP检测中进行单位点测序，被认为是SNP检测的金标准，但是由于通量低、成本高，在SNP检测中无法广泛使用。之后，SNPshot、SNPlex、Taqman、质谱检测、单碱基延伸（single base extension，SBE）和焦磷酸测序（pyrosequencing）等技术都在法医学SNP检测中发挥了重要的作用［7-9］。
随着人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）的成功，科学家们开
始了新一代测序技术（next generation sequencing，NGS）的研发，以建立更先进、更快速、更高通量的测序技术，克服第一代测序技术成本高、通量低及对人力需求大等缺陷。基于大规模平行测序（massively parallel sequencing，MPS）的二代测序（second generation sequencing，SGS）技术应运而生。第一台SGS平台是Roche公司推出的基于焦磷酸测序原理的454基因组测序仪［10］。之后其他SGS测序方法及相关平台的研发进入了新的发展阶段，相关研究文献也呈指数增长。与传统测序技术相比，SGS测序无论是测序原理、测序过程、适用范围还是测序结果都存在本质的不同，给生物学领域带来新的突破，对法医遗传学这一应用性学科也带来了冲击和挑战。从2012年起，应用SGS技术平台对法医学常用遗传标记（STR和SNP）及mtDNA和RNA的研究进入白热化［10-25］，部分生物公司开始针对法医学应用研发适当通量的SGS检测平台及相关商品化试剂盒［22-23］。另外，也有学者开始关注第三代测序技术（单分子测序技术）在法医学的相关应用［10］。本文就目前常用的SGS平台在法医遗传学中的研究进展及展望进行综述。
2 常见法医学SGS平台及原理
目前市场上SGS平台根据测序原理、测序通量的不同可分为多种类型，适用于不同的科学研究目的。本文仅以Roche、Illumina和Life Technologies三大测序技术公司推出的SGS平台为例，探讨其原理及在法医遗传学中的应用潜能。 2.1 Roche 454基因组测序仪
2005年底，Roche 454基因组测序仪的推出开创了高通量测序技术的先河。454基因组测序仪使用的是一种类似焦磷酸测序的创新测序方法，利用“Pico
二代测序技术在法医学中的应用进展
