单克隆抗体制备实验过程
一、 免疫动物
免疫动物是用目抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞过程。 一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定免疫方案进行免疫注射。 抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。
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说明：FCA，弗氏完全佐剂；FIA，弗氏不完全佐剂；Quickantibody，北京康碧泉公司研制佐剂。上表中第四种免疫方法产生抗体大部份都为IgM，存在亲和力弱等缺点，慎用。
PS：1、一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂抗原，每只小鼠注射6-8个点为宜。
2、腹腔注射时，如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连情况，造成后期取出脾脏麻烦。
3、冲击免疫完成后，应在96小时内完成细胞融合，否则相应B细胞数量会下降到未冲击前水平。
二、细胞融合 （Cell fusion）
【材料和试剂】
（1）骨髓瘤细胞悬液 选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期
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细胞或体内生长肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。
（2）免疫小鼠脾细胞悬液 取3天前加强免疫小鼠，眼眶放血，?分离血清冻存备用。拉颈处死小鼠，浸泡于75％酒精中3～5min。无菌操作取出脾脏，置入盛有5ml不完全培养液平皿中洗涤，剪去周围结缔组织，将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液平皿中钢网上，先用剪刀剪成3～5个小块，然后用注射器内芯研磨。将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中，加不完全培养液50ml，1000r/min离心5min，弃上清，再以同法洗涤离心一次。然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中，计活细胞数，一般一只小鼠可得0.5～2×108 个脾细胞。
（3）饲养细胞 将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊从后
腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1分钟，随后吸出注入培养液。1000r/min离心5-10分钟，弃上清。先用5ml HAT培养基将沉淀细胞悬浮，根据细胞计数结果，补加HAT培养基，使细胞浓度为2×105/ml，备用。
（4）主要试剂配制
①细胞培养基杂交瘤技术中使用细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）两种基础培养基，配好后过滤除菌（0.22um），分装，4℃保存。
不完全RPMI-1640培养基： RPMI-1640培养基原液 100×L.G.溶液 双抗溶液 7.5%NaHCO3溶液 HEPES溶液 96ml 1ml 1ml 1-2ml 1ml 不完全DMEM培养基： DMEM 3 / 13
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单克隆抗体制备实验过程
