1细胞培养的概念？习惯上泛指所有的体外培养，即器官培养，组织培养，和细胞培养的总称。 在无菌条件下,从动物(植物也可)或在人体中取出组织或细胞,置于模拟体的生理环境中(无菌,适当的温度和一定的营养条件)使之生存和增殖生长的技术方法。用于研究细胞、组织的代、增殖、分化、形态和功能变化，各种理化因子对活细胞的影响。 2体外细胞的分化特点？细胞分化：在个体发育过程中，子代细胞产生形态、结构和功能差异的过程。（细胞的形态结构、生化特征、生理功能为细胞分化的三项指标），由于体外培养细胞失去了神经、激素等体液的调节和细胞间相互影响，经多次传代增殖，久之则发生如下变化:分化现象逐渐减弱或不显，形态与功能趋于单一化，或传一定代数后衰老死亡；发生转化，获不死性而成为能无限传代的连续细胞系或恶性细胞系。 3体外培养细胞的分型 ？并说明各自的形态特点?分型:1 贴壁型细胞(上皮细胞型,成纤维细胞型,游走细胞型) 2悬浮型细胞. 形态特点1.上皮样细胞型:仅形态上似体上皮细胞，实际上不完全等于体同名的细胞。来源：来源于外胚层，胚层细胞 如：皮肤及其衍生物 ；消化道，乳腺，肺泡 ；上皮性肿瘤形态：类似体的上皮细胞。扁平，不规则多角形，中有圆形核。生长特点：易相连成片，相靠—紧密相连—成薄层—铺路石状。生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动。2.成纤维样细胞型名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的细胞来源：由中胚层间质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞；心肌，平滑肌，成骨细胞形态：似体成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形胞质向外伸出2—3个长短不等的突起中有卵圆形核.生长特点： 排列成放射状，漩涡状 并不紧靠连成片， 细胞—细胞接触易断开而单独行动,游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起.3.游走型细胞(不定型)：本型细胞在支持物上散在生长，一般不连成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快且不规则.常见于羊水细胞培养的早期.4．悬浮生长型细胞
概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长.来源:来自血，脾或骨髓，尤以血中白细 胞多见，癌肿细胞也可能。特点：在悬浮液中生长良好、细胞圆形，单个或小细胞团。优点：生存空间大，提供数量大， 传代方便(不需消化) 易于收获可获得稳定状态.缺点：观察不方便 很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)
4那些培养条件改变时，细胞形态可有变化？（见表一）组织和细胞供体年龄。培养条件。细胞的粘附。培养技术方法。促生长因子。组织和细胞供体年龄：幼年个体比老年者易于培养，所有动物的胚胎组织都是最好的培养对象。来自同一个体的组织，分化低的比分化高的容易培养。培养条件：不同的细胞对培养基需求不同，当前尚无一种培养基是万能的，应选择相应的培养基。应了解所培养细胞的生物学形状和特殊需求成分。血清，Hela：高血清成纤维细胞样低血清上皮样细胞。pH，Hela：太酸或太碱，成纤维细胞样；标准pH，上皮样细胞。
细胞密度 3T3：低密度，成纤维细胞样，高密度，上皮样细胞。生长状态改变：悬浮或贴附：悬浮时圆形 ，贴附成纤维或上皮样。转化与否：未转化，成纤维样，转化后，可成上皮样。
5简述每代贴附生长细胞的生长过程分哪几期？游离期 ： 细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态．也称悬浮期此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。贴壁期：细胞附着于底物上，游离期 结束。细胞株平均在10分钟～4小时贴壁。潜伏期此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为6～24小时。对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。机制：接触抑制、密度依赖性。（接触抑制：当一个贴壁生长的体外正常细胞生长至与另一个细胞的表面相互接触时，便停止了分裂增殖，相互虽然紧密接触，但不形成交叉重叠生长，也不进入S期。密度抑制（density inhibition）：细胞数量到一定数量后引起抑制增殖的现象。 6影响贴壁的因素和促进细胞粘附措施有哪些？1因素：（1）各种细胞强弱： (附着最强)巨噬细胞、成纤维细胞；上皮细胞、血细胞(最弱)。（2）生物因素：血清、培养液中的促附着因子。（3）机械，物理等因素（离心：促进附着。流动：培养液流动可阻止细胞附着。低温：可抑制附着）2措施：（1）包被：对分化程度高、生长能力差的细胞，可在培养瓶皿表面包被有利于细胞粘附和生长的生物活性物质. 血清含有多种能够促进细胞粘附的成分，细胞本身也可能产生一些粘附分子。（2）减少接种时培养液的量：待细胞粘附和贴壁之后，再补充足够的培养液。（3）减少培养液中血清的含量，使培养液黏度降低。（4）培养液中离子成分及其浓度。如，培养液中的Ca2+含量过低时不利于细胞的粘附、贴壁和铺展。（5）培养液的温度: 低温会减低细胞的活动，妨碍黏附和贴壁 。 7原代培养的概念：取自体新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养 。原代培养与体原组织很相似，具异质性，相互依存性强，细胞克隆形成率低。此期一般持续1～4周。
8简述体外培养细胞的分期？⑴原代培养期:取自体新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养 原代培养与体原组织很相似，具异质性，相互依存性强，细胞克隆形成率低。此期一般持续1～4周。⑵传代期:细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中（不论稀释与否）。持续
时间最长，其特 点是细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型。⑶衰退期:此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。
9举例说明细胞生长曲线的制作方法？⑴计算细胞浓度2次，得出细胞浓度平均值。然后，将细胞悬液等量加入培养板的每个孔中，培养时间7天。⑵每隔24小时吸去3个孔的培养板，加入消化液，混悬细胞，计算细胞数目。每个孔计数2次，得出细胞浓度平均值。⑶绘制细胞生长曲线，横坐标为培养时间，纵坐标为细胞浓度。 10. 体外培养细胞生长的条件（1） 细胞的营养需要：氨基酸、单糖、维生素、
无机离 子、微量元素、激素、效应已得到证明，但对血清中阻留,达到除菌台的酒精、PBS、
的目的. 培养基、胰蛋白生长因子等。（2） 细胞的生存环境：温度: 37 ℃、O2 、CO2: 5% CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ +
HCO3-、pH: 7.2-7.4、渗透压。（3） 无污染。 （4） 无毒 11. 选择血清需注意事项有哪些？注意事项：①血清质量好坏是实验成败的关键。②常用血清有胎牛血清（剖腹产）、新生牛血清（小于24h）、小牛血清（10～30D）、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。③优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。④血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃ ，30 分钟。⑤血清的消毒：过滤除菌⑥一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死．但支持细胞生长一般需加 10％血清．⑦对于血清支持细胞生长的生物学的复杂成分至今尚未完全清楚．⑧血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。 12. 简述完全培养基的组成及配制方法?组成：基础培养基80％一95％血清 5％一20％
碳酸氢钠2.0 g/L青、链霉素 各100单位／毫升. 配制方法:⑴认真阅读说明书⑵配制时要保证充分溶解，各种物质要在培养基完全溶解后添加⑶配制水应为双蒸水或三蒸水⑷所用器皿应十分清洁⑸配制好后马上过滤，低温无菌保存。 13.什么时候需要进行过滤除菌？简述过滤除菌的全过程？将液体或气体用微孔虑膜过滤,使大于孔径的的细菌等微生物颗粒常用于不易高压灭菌的物品。如：培养液、各种酶类等。 14.细胞培养实验中，使用过的玻璃和塑料制品应如何处理后重复使用？1. 常用玻璃器皿清洗：浸泡（自来水）--刷洗（洗洁精）--酸泡5％盐酸过夜（不少于6小时）--流水冲洗--蒸溜水浸泡和冲洗（注满水－倒空）--50℃烘干--121℃高压蒸汽灭菌20min 2. 塑料制品的清洗： 料自制品现多是采用无毒并已经特殊处理的成品，打开包装即可用,多为一次性物品。必要时用：2% NaOH浸泡过夜--自来水充分冲洗 ，清洁液洗刷 5%盐酸溶液浸泡30分钟--自来水和蒸馏水冲洗（15－20遍）--晾干备用 ,紫外线直接照射或辐照灭菌 15．无菌操作的注意事项？1.凡是带入超净工作酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面2.靠近酒精灯火焰操作。 3.器皿使用前必须过火灭菌4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到
废液缸。6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染 16. 分别指出下列物品通常使用那种消毒方法进行消毒？（培养室、工作台、，玻璃制品、，金属器械、，塑料制品，橡胶制品，培养用液、，布类）.消毒方法分为三类： （A） 物理灭菌法（紫外线、湿热、过滤等）。 （B） 化学灭菌法（各种化学消毒剂）。 （ C） 抗生素。1. 紫外线消毒：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒和培养器 。紫
外线灯应距地面 已2.0米为宜，且消毒的物品不宜相互遮档，照射不到的地方起不到消毒作用。时间30分钟。2. 温热消毒：即高压蒸气消毒，是一种使用最广泛、效果最好的消毒方法。常用物品消毒压力及时间：培养液、橡胶制品10磅10分钟；布类、玻璃制品、金属器械18磅20分钟。3. 过滤消毒：将液体或气体用微孔虑膜过滤,使大于孔径的的细菌等微生物颗粒阻留,达到除菌的目的.常用于不宜高 压灭菌的物品。如：培养液、各种酶类等。4化学消毒法：利用消毒剂来消毒那些不能用物理方法消毒的物品和场地。最常见的是75%酒精及1‰的新洁而灭，前者主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室的壁面处理。后者则主要用器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒。 5抗生素消毒：即抗生素灭菌，主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染。 17. 你认为细胞培养中微生物污染主要是通过那些途径导致的，并简要说明。(1)空气：空气是微生物传播的最主要途径。如净化工作台使用过久，滤器受尘埃阻塞，可使净化工作不能正常进行。工作时不戴口罩或面对操作野大声讲话、咳嗽等使外界气流过强。污染空气可侵入操作野，造成污染。因此工作时减少空气流动是防止污染的重要环节。(2)器材：各种培养器皿及器械清洗消毒不彻底，例如洗刷不干净．污物残留及培养用液等灭菌不彻底都可以引入有害物质。另外需要注意的是CO2温箱．由于温箱湿度大，温度适宜，取存细胞时不慎将培养液漏出，易使细菌、霉菌孽生，而CO2温箱是开放式培养．如不定期消毒,可形成污染. (3）操作：实验操作无菌观念不强、动作不准确、使用污染的器具．或封瓶时不严，都可发生污染。培养两种以上细胞时，操作不规、交叉使用吸管或营养液瓶等有可能导致细胞交叉污染。(4)血清：有些血清在生产时就已被支原体或病毒等污染，即可成为污染的来源。 (5）组织样本：原代培养的污染多数来源于组织样本；另一方面手术时使用碘酒消毒，这些混入组织中的碘可以影响细胞生长。 18.常用清洁液的配制成分有哪些？配制时需注意什么？（见表二） 19.常用的胰蛋白酶的浓度是多少？应如何配制?如何终止其活性？胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。胰蛋白酶是一种黄白色粉末，溶解及作用的最佳PH是8－9，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制，常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％ 。用滤器过滤除菌。胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 （1）EDTA液：常用浓度为 0.02％，配制时采用无Ca2+、Mg2+平衡盐液溶解，高压灭菌后即可使用。（2）胰蛋
白酶、EDTA:胰蛋白酶和EDTA联合使用可提高消化率，但需注意EDTA不能被血清中和，消化后要彻底清洗，否则细胞易脱壁。（3）胶原酶：适于消化分离纤维性组织、上皮及癌组织，可使上皮细胞与胶原成分分离而不受损害。钙、镁离子和血清成分不会影响胶原酶的消化作用，因而可用BSS或含血清
的培养液配制，这样实验操作简便同时提高细胞成活率。但胶原酶价格较高，大量使用将增加实验成本。胶原酶的常用剂量为 200 U／ml（约为 lmg／ml）或 0．03％－0．3％。最佳PH是6.5。 20.名词解释： 细胞株 密度抑制 接触抑制 原代培养 传代 1细胞株（cell strain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养物称细胞株。 2密度抑制（density inhibition）：细胞数量到一定数量后引起抑制增殖的现象
3接触抑制（contact inhibition）：细胞汇合相互接触后失去运动的现象。
4原代培养（primary culture）：从体取出细胞或组织的第一次培养。 5传代（passage）也称再培养无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。也称再培养。 21．细胞冻存与复的基本原则是什么？1慢冻快融2当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞形成冰晶。3如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。 22．冻存液的作用是什么？（1）保存种子细胞，以便随时取用。这是保存细胞的最主要目的。（2）减少细胞被微生物污染的危险性。（3）减少细胞之间交叉污染的危险性。（4）减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变。（5）避免有限细胞系出现衰老或恶性转化。 降低人力和物力。
23．为什么细胞计数时，细胞悬液逸出槽外时要重做？公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。 公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1：1稀释。 公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为： 1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3 24. 在细胞培养中如何防止污染？（1）使用抗生素清除细菌和真菌。预防用药一般用双抗生素，污染后清除用药需采用大于用量5~10倍的冲洗法。于加药后作用24~48小时，再换常规培养液。（2）用MRA（mycoplasma removal agent）处理细胞，每4天换一次液，连续处理15天清除支原体效果好。另外将受支原体污染的细胞放置在41℃作用5—10h．最长不超过18h，以
杀灭支原体． 25. 培养细胞的生长测定方法1,细胞计数法2,台盼兰染色法3,MTT比色法4,细胞生长曲线法5,[3H]-TdR([3H]-胸腺嘧啶核苷）掺入法6,BrdU
(5-bromo-2—deoxyuridine，5-溴脱氧尿嘧啶核苷 ）掺入法 26. 如何估计是否传代及传代的方式？估计:(1)细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面以前，不要急于传代。(2)原代培养时细胞多为混杂生长，上皮样细胞和成纤维样细胞并存的情况很多见．传代时不同的细胞有不同的消化时间，因而要注意观察及时进行处理。并可根据不同细胞对胰蛋白酶的不同耐受时间而分离和纯化所需要的细胞。另外，早期传代培养的细胞较已经建系的培养消化时间相对较长。吹打细胞时动作要轻巧尽可能减少对
09级细胞生物学技术
