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激光共聚焦显微镜的组成及使用维护
作者：王文洁
来源：《电子技术与软件工程》2024年第03期
摘 要 介绍了激光共聚焦显微镜（FV1000MPE，Olympus）的组成和技术参数，并根据日常使用情况和积累的经验，总结了该套系统的使用及日常维护方法。 【关键词】激光共聚焦显微镜 组成 使用及维护
激光共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope，LSCM）是20世纪80年代随着光学、视频、计算机等技术飞速发展而诞生的新一代显微镜，在传统光学显微镜基础上，LSCM使用单光子激光作为光源，采用共扼聚焦原理和装置，利用计算机对观察对象进行数字图像处理观察、分析和输出。可对样品进行断层扫描和成像，得到高分辨率的薄层光学切片（XY）；观察和分析细胞的三维空间结构，得到多维度成像结果（XYZ）；或完成样品的长时间延时序列成像（XYT）。LSCM已成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学等领域中强有力的研究工具。笔者根据多年以来在本单位大型仪器共享平台上维护激光共聚焦显微镜（FV1000MPE，Olympus）的工作经验，对该套系统的组成、使用和维护做出如下总结与交流：
1 激光共聚焦显微镜（FV1000MPE，Olympus）的组成和技术参数 1.1 激光光源
包括四个独立的覆盖可见光波长范围的激光器（提供6个不同波长）：
（1）近紫外激光器：405nm，25mW，适用于DAPI、Hochest等染料以及FRAP等光刺激实验；
（2）多谱线氩离子激光器：458nm、488nm、515nm，30mW，适用于FITC、GFP、YFP、ALEX488等染料；
（3）绿色激光器：559nm，15mW，适用于PI、Texas等诸多染料；（4）红色激光器：635nm，20mW，适用于CY5、CY5.5等染料。
采用AOTF型激光整合器，将各激光器发出激光整合后通过光纤传输至扫描装置，使不同激光器作为一个整体工作。按需要控制激光在样品扫描中的强度，强度调节范围是0.1%-100%，0.1%精度步进，实现任意区域内的激光强度控制和波长选择。 1.2 扫描单元
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后置式扫描单元，光谱型共聚焦荧光探测器，内置3个独立光电倍增管荧光探测通道（PMT），其中包括两个光谱通道和一个自动滤色片通道。提供CH1和CH2通道精确的光谱扫描功能，采用光栅分光、狭缝收集。配备3个荧光通道，及1个透射光通道用于记录微分干涉图像（DIC）。通过软件控制可实现多种扫描方式，除X、Y、Z、T任意组合等常规扫描方式外，还支持点扫描、线扫描（直线和任意曲线）、矩形扫描、双向扫描、序列扫描、Zoom 1×—50×（局部放大扫描）等扩展扫描方式。 1.3 倒置荧光显微镜
倒置研究级电动显微镜-IX81主机，包括电动载物台、6位物镜转盘及100%光路转换器。10×、20×低倍物镜、40×油镜（NA=0.95）、超级色差校正物镜60×油镜（NA=1.35），100×油镜（NA=1.4）均具有微分干涉（DIC）拍摄功能。以上物镜能够兼顾生物样本的荧光及DIC观察拍照。
1.4 活细胞恒温培养系统
配备高级焦点防漂移ZDC和系统适配器，活细胞培养小室可保持恒定CO2、温度和湿度，保证培养皿内活细胞能进行长时间的延时序列成像。 2 激光共聚焦显微镜操作规程
标准开关机流程（所有硬件设备需要先开开关、后开钥匙）： （1）开启电动显微镜控制器：IX2-UCB；
（2）开启汞灯电源：U-RFL-T （开启半小时内不能关闭）； （3）开启电动载物台控制器：PRIOR； （4）开启主扫描单元控制器：MAIN-PSU； （5）开启SIM扫描单元控制器：SIM； （6）开启488多线氩离子激光器电源；
（7）开启559激光器电源（两个绿灯都亮时，开启钥匙，稍后等两个红灯都点亮时，激光出光稳定，此时可使用559激光）；
（8）开启405/635/AOFT电源控制器：FV10-MCPSU； （9）开启电脑；
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（10）开启软件FV10-ASW；
（11）获取图像：使用倒置荧光显微镜观察生物样本，找到观察区域，关闭显微镜荧光光闸（shutter），使用激光进行扫描预览，采用Focus×2键快速预览，调整激光器（Laser）输出功率、探测器灵敏度（HV）、光电倍增管增益（gain）、降噪（offset）等，以达到最佳成像效果。为防止荧光串色，选用顺序扫描模式（seqential），降低扫描速度，并选用kalman去噪模式，获取图象并保存；
（12）关机（所有硬件先关钥匙，后关开关）：先关软件和电脑，再关闭各个硬件控制器。注意：488多线氩离子激光器电源钥匙关闭之后，等待5-10分钟，再关闭开关（以保证风扇继续工作5-10分钟，保证仪器散热）。 3 激光共聚焦显微镜系统的日常管理与维护
“工欲善其事，必先利其器”，激光共聚焦显微镜作为使用率极高的大型精密仪器，它的正常运转离不开科学的日常管理及养护。 3.1 仪器负责人管理制度
为激光共聚焦显微镜指定仪器负责人，由专人负责仪器的开关机，规范的开关机对于仪器，尤其是激光器及汞灯的维护极为重要，并由负责人每天检查仪器的运行状态。 3.2 仪器预约使用
激光器和汞灯均属于耗材性的配件，使用寿命有限。尤其是激光器，价格昂贵，在几万至几十万元不等。充分利用好仪器的开机时间，避免仪器空转显得格外重要。本中心要求使用人员通过仪器共享平台的网络预约，依次按序预约使用仪器。一旦出现超过半小时以上的空档时间，由仪器负责人及时协调仪器使用，通知预约较晚时间点的人员提前使用，避免仪器开机空转造成的浪费。
3.3 使用光盘或者网盘保存数据
严禁插拔U盘或者硬盘拷贝数据，使用仪器共享管理系统的网盘传输或者光盘刻录数据结果，杜绝病毒侵染激光共聚焦显微镜系统。 参考文献
[1]王珺，王燕，龚坚，唐微.激光共聚焦显微镜的应用技术[J].现代仪器，2009，15（04）：50-52.
激光共聚焦显微镜的组成及使用维护
