SSR技术
1. SSR 简介
说明：简单重复序列 (Simple Sequence Repeat，SSR)，简单重复序 (SSR)也称微卫星 DNA ， 其串联重复的核心序列为
1-6 bp，其中最常见是双核苷酸重复，
即(CA) n 和(TG) n 每个微卫
星 DNA 的核心序列结构相同，重复单位数目 的不同。
10-60 个，其高度多态性主要来源于串联数目
SSR标记的基本原理 ：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过 PCR 反应扩增微
PCR 在
卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同， 因而能够用 PCR 的方法扩增出不同长度的 产物， 将扩增产物进行凝胶电泳， 根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。 真核生物中，存在许多
2-5bp 简单重复序列，称为 “微卫星 DNA” 其两端的序列高度保守，
可设计双引物进行 PCR 扩增，揭示其多态性。
SSR具有以下一些优点 ：(l) 一般检测到的是一个单一的多等位基因位点； 显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；
(2)微卫星呈共
(3)所需 DNA 量少。显然，在采用 SSR 技术分析微
DNA 序列的信息。 如不能直接从 DNA 数据库
卫星 DNA 多态性时必须知道重复序列两端的 查寻则首先必须对其进行测序。
SSR的分类 ：根据 SSR 核心序列排列方式的不同， 可分为 3 种类型：1）完全型 (perfect) ， 指核心序列以不间断的重复方式首尾相连构成的 ATATATATATATATATATATATATATATATATAT
DNA 。如：
；2）不完全型 (imperfect) ，指在 SSR 的
3 。如：
核心序列之间有 3 个以下的非重复碱基 ,但两端的连续重复核心序列重复数大于 ATATATATGGATATATATATCGATATATATATATATATGGATATATATAT 合型(compound) ，指 2 个或 2 个以上的串联核心序列由 基分隔开 ,但这种连续性的核心序列重复数不少于 ATATATATATATATGGGATATATATATATA 的一种类型。
SSR在植物基因组中的分布 ：SSR 广泛分布于各种真核生物的基因组中， 50kb 就存在一个 SSR。哺乳动物中的 SSR 的数量大约为植物中的
；3）
复
3 个或 3 个以上的连续的非重复碱
5 。如：
。3 种类型中完全型是 SSR 标记中应用较多
大约每隔 10～
5～6 倍。在植物中，平
均 23.3kb 就有一个 SSR；双子叶植物中的 SSR 数量大于单子叶植物， 前者两个 SSR 之间的 平均间距为 21.2kb ，后者为 64.6kb；核 DNA 中的 SSR 数量多于细胞质 DNA 中的 SSR，绝 大多数单碱基重复型及
2 碱基重复型 SSR 存在于非编码区， 3 碱基重复型多位于编码区。
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微卫星的利用价值： 由于核心序列重复数的不同，等位的 SSR 位点可呈现出多态性
（SSLP，simple sequence length polymorphism ）。大多表现为共显性遗传，有的表现为显性 遗传。由于 SSR DNA 两侧序列（离开 20bp 以上）表现出保守特征，所以可设计出上下游 PCR 引物， 扩增出包含 SSR 的 DNA 序列。 微卫星分析常用于： 遗传图谱构建； 种质鉴定； 遗传多样性分析； 标记辅助选择 （MAS ，marker- assistant seletion，marker- aided seletion）； 基因定位；数量性状基因座（
QTL ）分析；系谱分析；亲源关系鉴定等。
SSR引物的来源： 借鉴其他近缘种序列。 1）通过筛选文库、 测序开发自己的 SSR 引物。 2）通过核酸数据库查询，从已有序列中搜寻包括
SSR 的序列并设计引物。
SSR分析实验的主要技术环节： 提取 DNA；PCR 扩增；电泳及显色；电泳胶板带型的 照相、记录；数据分析处理。其中，
PCR 产物分离的电泳方法主要有：高浓度琼脂糖电泳
（4%胶只能分辨 4-6bp 差异） ；变性聚丙烯酰胺序列胶电泳； 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。 由于扩增的片段短 (一般小于 300bp)，基因间的差异小 (一般为几个 bp)，故通常使用分辨率 高的聚丙烯酰胺凝胶电泳。 在程序上， 变性胶虽然比非变性胶麻烦些，
但考虑到在非变性胶
上会出现人为假象 — 异源双链分子， 比如导致 SSR 杂合子中出现 3-4 条带， 而不是正常的 2 条带，从而干扰等位位点统计，因此我们建议在
SSR 分析中均采用变性胶电泳。
2. ISSR 分子标记的实验原理及操作流程
原理： ISSR（inter-simple sequence repeat）标记是一种类似 RAPD，但利用包含重复序 列并在 3’或 5’锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统，即用 重复序列之间的区域。其原理具体是，
ISSR 标记根据生物广泛存在
SSR 引物来扩增
SSR 的特点，利用在生
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物基因组常出现的 SSR 本身设计引物， 无需预先克隆和测序。 用于扩增的引物一般为 个碱基序列， 由 1-4 个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成，
从而保证了引物
与基因组 DNA 中 SSR 的 5’或 3’末端结合，导致位于反向排列、间隔不太大的重复序列间 的基因组节段进行 PCR 扩增。 一、实验材料
不同来源的 DNA(30-50ng/ul) 。 二、实验设备
PCR 仪，PCR 管或硅化的 0.5ml eppendorf 管，电泳装置，凝胶成像仪。 三、试剂
1、ISSR 引物： 购买成品或根据加拿大 附录）自己合成
British Columbia 大学设计的 ISSR 引物序列 （见
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2、Taq 酶 3、10xPCR 缓冲液 4、MgCl 2：25mmol/L 5、dNTP ：2.5mmol/L 。 四、操作步骤 ：
1. 在 25ul 反应体系中，加入
模板 DNA 1ul (30-50ng) 10xPCR Buffer 2.5ul dNTP 2ul
加 ddH2O 至 25ul
ISSR 引物 1ul (约 5pmol) MgCl2 2ul
Taq 酶 1 单位（ U）
混匀稍离心 , 加一滴（约 20 ul）矿物油。
2. 在 PCR仪中预变性 94℃ 2 分钟, 然后循环 : 94℃ 1 分钟， 45℃-68℃40 秒， 72℃ 1-2 分钟，共 40 轮循环。
3. 循环结束后 , 72℃ 10 分钟， 4℃保存。
4. 取 PCR 产物 15ul 加 3ul 上样缓冲液 (6x) 于 1.6% 或 1.8% 琼脂糖胶上电泳 , 稳压 50-100Ｖ（电压低带型整齐，
分辨率高）。
20 分钟。
5. 电泳结束，溴化乙锭染色 6. 用凝胶成像仪观察、拍照。 操作流程简图：
3. SSR GEL and Silver Staining Protocol
Paula Marquardt & Craig Echt
Published in: Echt CS, May-Marquardt P, Hseih M, Zahorchak R. 1996. Characterization of microsatellite markers in eastern white pine. Genome 39:1102-1108.
Comments can be directed to Paula Marquardt at: USDA Forest Service Research 5985 Highway K
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Rhinelander, WI 54501 USA
Phone: 715-362-1121 Fax: 715-362-1166
e-mail: pmarquar@newnorth.net
I. EQUIPMENT:
DNA sequencing unit (35 x 45 cm) & 2000V power supply Clamps
Lg. plastic trays (4), about 43 x 50 x 8 cm, and one lid Two rocking platforms
Heat block for microtiter plates. A microplate vortexer is helpful. II. MOLD ASSEMBLY:
Notes: Bind silane is toxic and should be used in a chemical fume hood. Wear gloves when handling this solution. Use a small piece of vinyl tape on a lower
outside corner of the acrylease
treated glass gel plate to mark the untreated side and also help distinguish the plates. This helps avoid confusion between plates when using offset plates. The tape can remain in place through several electrophoresis / washing cycles.
1. Wash inner and outer plates well with alconox cleanser. Rinse well with tap water, deionized or distilled water, and ethanol, air dry. Use dedicated sponges for each treatment.
2. Using a kimwipe tissue, coat the inner side of notched or offset plate with acrylease (Stratagene) and allow to dry--I do not treat the top 2 inches of the plate since I feel that the nonstick coating promotes leaking between wells behind the teeth of the comb. Buff well with a kimwipe soaked in ethanol for a clean finish; this takes some elbow grease to get the streaks off of the plate. Change gloves before working with bind silane and take care not to cross contaminate the plates with the two treatments. The acrylease treatment only needs to be repeated every four gels or so.
3. Prepare fresh 1 ml binding solution by making a solution 0.0005-0.001% bind silane (Sigma #M-6514) in 95% ethanol, 0.5% glacial acetic acid. Apply with a kimwipe and coat the
inner side of the larger plate with one ml and allow to dry 4-5 minutes. Wipe the plate with
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ethanol in one direction and then perpendicular to first direction, don%use too much pressure. This treatment needs to be repeated every time. III. GEL SOLUTION PREPARATION:
Note: Acrylamide is toxic. Wear gloves when handling solution and face mask when weighing out powder. A safer alternative is to buy a premix.
1. Rinse all glassware and plastic ware with d.i. water prior to gel solution preparation and pouring, including the disposable filter unit.
2. Gels are 6% acrylamide, 8M urea, 1X TBE. For each gel, mix together 50 g urea, 15 ml 40% 19:1 acrylamide solution, and 31 ml d.i. water. We use a 4.5% gel for fingerprinting reactions.
Note: (We store aliquots of premixed 40% Acrylogel solution, Gallard-Schleisinger Ind., at -20℃.)
3. Warm and stir the mixture in a beaker of warm water until all the urea is dissolved. Add 1.25 g of amberlite resin and stir 5 min. Filter through a 0.2 uM filter and degas at 25 mg Hg for 5 min. Transfer to graduate cylinder and add 10 ml 10x TBE, bringing volume to 100 ml with d.i. water.
4. We have recently started using Burst-Pack from Owl Scientific, which is an acrylamide premix including the buffer and catalysts, for our fluorescent gel work and are very pleased with the quality and reproducibility. This would be an option for the silver staining work as well. The burst-pack\eliminate the c hemical weighing and mixing, deionizing, filtering and degassing steps.
IV. GEL POURING:
1. Immediately prior to pouring, add 500 ul 10% ammonium persulfate (0.1 g + 1 ml d.i. water) to the acrylamide mix in a beaker, gently mixing well. Then add 50 ul TEMED and mix. Polymerization will not start until TEMED has been added. Do not mix the catalysts together before adding to the polyacrylamide solution--this will inhibit polymerization.
2. We use the Otter adjustable gel caster (OWL Scientific, Inc.) for pouring gels. In this system the gel is poured horizontally with the top plate sliding over the bottom plate, without the use of tape, grease or a bottom spacer.
a. Place the larger plate onto caster so that it abuts the end wall of the caster. Moisten spacers with water and place them flush to the edge of glass against the caster wall.
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SSR技术原理,方法及步骤课件.doc
