实验一 组培器皿及器械的洗涤、灭菌及环境的消毒
一、实验目的
通过实验，使学生了解并掌握组织培养用实验器皿及器械的洗涤、灭菌，环境的消毒方法。 二、实验原理
实验仪器及器械的清洗、消毒和灭菌是组织培养成功的关键所在，是外植体免受污染的前提。由于灭菌剂的种类不同，所以选择消毒剂既要考虑良好的消毒、杀菌作用，同时易被蒸馏水冲洗掉。
无菌的环境是植物组织培养成功的前提，因为绝大多数操作程序要求在无菌条件下进行。 三、实验操作步骤 （一）器皿与用具的洗涤
1、玻璃器皿的洗涤
新购置的玻璃器皿或多或少都含有游离的碱性物质。使用前要先用1%稀HCL浸泡一夜，再用肥皂水洗净，清水冲洗后，再用蒸馏水冲洗1次，晾干后备用。用过的玻璃器皿，用清水冲洗，蒸馏水冲洗一次，干后备用即可。
对于已被污染的玻璃器皿则必须在高压蒸汽灭菌后，倒去残渣，用毛刷刷去瓶壁上的培养液和病斑后，再用清水冲洗干净，蒸馏水冲淋一遍，晾干备用，切忌不可用水直接冲洗，否则会造成培养环境的污染。清洗后的玻璃器皿，瓶壁应透明发亮，内外壁水膜均一，不挂水珠。
2、金属用具的洗涤
新购置的金属用具表面上有一层油腻，需擦净油腻后再用热肥皂水洗净，清水冲洗后，擦干备用。用过的金属用具，用清水洗净，擦干备用即可。
3、每人清洗部分玻璃器皿
清水洗净→浸入洗衣粉溶液中洗刷→清水反复冲洗→蒸馏水淋一遍→烘干备用。
对于较脏玻璃器皿的洗涤：采用先碱后酸的方法，即用洗衣粉洗刷后冲洗干净→晾干→浸入酪酸洗液（一种强氧化剂，去污能力强，配制方法：重铬酸钾40克，溶解在500ml在水中，然后徐徐加入450ml粗制浓硫酸），浸泡时间视器皿的肮脏程度而定→清水反复冲洗干净→蒸馏水淋洗一遍→烘干备用。
对于带有石蜡或胶布的器皿：先将其除去，再用常规洗涤，石蜡用水煮沸数次即可去掉，胶布粘着物则需用洗衣粉液煮沸数小时，再用水冲洗，凉干后浸入洗液，以后的步骤同前。
（二）玻璃器皿、用具及环境的灭菌 1、玻璃器皿和用具的灭菌 （1）采用干热灭菌法：
将洗干净晾干后的培养皿、三角瓶、吸管等玻璃用具和解剖针、解剖刀、镊子等金属器具，用纸包好，放进电热烘干箱，当温度升至100℃时，启动箱内鼓风机，使电热箱内的温度均匀。当温度升至150℃时，定时控制40min（或120℃定时120min）,达到灭菌目的。 （2）采用高压蒸汽灭菌法：
即用手提式高压灭菌锅，在1.2个大气压下保持15～20分钟。有些如聚丙烯、聚甲基戊烯等类型的塑料用具也可以进行高温消毒。 （3）灼烧灭菌：
用于无菌操作的镊子、解剖刀等用具除高压蒸汽灭菌外，在接种过程中还常常采用灼烧灭菌，将镊子、解剖刀等从浸入95%酒精中取出，置于酒精灯火焰上灼烧，借助酒精瞬间燃烧产生高热来达到杀菌等目的。操作过程中要反复浸泡、灼烧、放凉、使用，操作完毕后，用具应擦拭干净后再放置。 2、环境的消毒
（1）地面、墙壁和工作台的灭菌
每次使用前，将配好的20%新洁尔灭（苯扎溴铵）溶液倒入喷雾器中，对接种室地面、墙壁、角落均匀地喷雾。在喷房顶时间，注意不要让药液滴入眼睛。然后开启紫外灯开关，照射15～30min，一般紫外线消毒后不要立即进入，应在关闭紫外灯15-20min后进入室内。 （2）无菌室和培养室的灭菌
消毒灭菌的方法：首先将房子关闭，定期用甲醛和高锰酸钾2：1的比例定期熏蒸灭菌24h或用70%的酒精或0.5%苯酚喷雾降尘和消毒。操作时要戴好口罩和手套，用甲醛与高锰酸钾配比时要注意避开烟雾，封闭消毒期间不宜进入消毒空间。
三、 实验报告
1．将本次实验内容整理成实验报告。
2. 试阐述为什么要对器皿和用具进行严格的洗涤和灭菌？
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实验二 培养基母液的配制与保存（MS培养基）
一、实验目的
通过学习MS培养基母液的配制与保存，掌握培养基母液浓度的换算、配制与母液的保存方法。 二、实验原理
培养基制备之前，为了使用方便和用量准确，常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物类、激素类分别配制成比培养基配方需要量大若干倍的母液。当制备培养基时，只需要按预先计算好的量吸取母液即可。 三、实验仪器、用具及试剂 （一） 实验仪器、器皿及用具
电子天平（感量为0.0001g、0.01g）,烧杯（1000ml，100ml，50ml）、量筒（1000ml，100ml，50ml）、容量瓶（1000ml，500ml，200 ml，100ml，50ml）、棕色或白色广口瓶（1000ml，500ml，200 ml，100ml）、药匙、玻璃棒、称量纸、标签、冰箱。 （二）试剂
MS培养基所需各种试剂、IAA、IBA、NAA、6-BA、2,4-D、GA3、KT、蒸馏水、重蒸馏水。 四、实验步骤与方法
母液的配制是按所使用药品的类别，而分别配成大量元素、微量元素、维生素、钙盐、镁盐和铁盐等。配制母液时特别要注意无机盐成分在一起，可能产生的化学反应，如Ca2+和SO42-,Ca2+,Mg2+和PO43-一起溶解后，会产生硫酸钙或磷酸钙的不溶物沉淀，因此不能配在一起作母液贮存，应分别配制和保存。
配制母液时要用双重蒸馏水等纯度较高的水，药品应采用化学纯或分析纯级，药品的称量及定容都要准确，各种药品先以少量蒸馏水使其充分溶解，然后按培养基上的排列顺序混合。
现以MS培养基(Murashige和Skoog,1962)为例叙述如下： (一)、大量元素母液（浓缩10倍）的配制
MS培养基配方中大量元素共有5种（表1-1），按照培养基配方的用量，各种化合物扩大10倍，用电子天平分别称好，分别用50ml烧杯称量，加30-40ml蒸馏水溶解。5种化合物分别充分溶解后，按顺序混合定容在1000ml量筒中，注意在混合定容时，一定要最后加入氯化钙，因为氯化钙与磷酸二氢钾形成磷酸
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三钙，磷酸钙之类是不溶于水的沉淀（也可将钙盐与镁盐单独配成母液存放），将配好的定容溶液倒入1000ml广口瓶中，贴好标签保存于冰箱的冷藏室中。
配置培养基时，每配1L培养基取此母液100ml。
表1-1 Murashige和Skoog大量元素的称量及定容
化合物名称
KNO3 NH4NO3
MgSO4·7H2O(无水MgSO4)
KH2PO4
CaCl2·2H2O(无水CaCl2)
培养基配方用量(mg/L)
1900 1650 370（190）
170 440（330）
扩大10倍称量(mg) 用于定容
19000 16500 3700（1900）
1700 4400（3300）
（二）、微量元素母液（浓缩100倍）的配制
MS培养基配方中微量元素共有7种（表1-2），按表中称取用量，用感量为0.0001g电子天平，分别称取后，均放入1000ml的一个烧杯中，加蒸馏水溶解，然后定容到1L容量瓶。贴好标签，放入冰箱保存。
配置培养基时，每配制1L培养基取此母液10ml。
表1-2 微量元素母液各化合物用量
化合物名称
MnSO4·4H2O (MnSO4·H2O) ZnSO4·7H2O CuSO4·5H2O H3BO3 Na2MoO4·2H2O KI
CoCl2·6H2O
培养基配方用量(mg/L) 22.3(16.9) 8.6 0.025 6.2 0.25 0.83 0.025
扩大100倍称量(mg)用于定容 2230(1690) 860 2.5 620 25 83 2.5
(三)、铁盐母液（浓缩200倍）的配制
目前常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。这种螯合物使用起来方便，比较稳定，又不易发生沉淀。配制方法是：用感量为0.01g的电子天平称取硫酸亚铁2.78g和乙二胺四乙酸二钠3.73g分别溶解在200ml蒸馏水中，两种溶液混合定容至500ml，用棕色广口瓶盛装，贴标签，放入冰箱保存。注意：两种盐用热水分别溶解,然后混合，放置于室温下10小时以上看是否有沉淀产生，然后才能使用。
配置培养基时，每配制1L培养基取此母液5ml。
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(四)、有机物母液（浓缩100倍）的配制
在MS培养基中，有机物配方成份有维生素和氨基酸（表1-3）。按表1-3中的用量用电子天平进行称量，分别溶解，混合定容至100 ml。贴标签，放入冰箱保存。
配置培养基时，每配制1L培养基取此母液10ml。
表1-3 有机物母液的称量
化合物名称 VB1(硫胺素) VB5（盐酸吡哆醇） VB6（烟酸）
肌醇 甘氨酸
培养基配方用量(mg/L)
0.4 0.5 0.5 100 2
扩大100倍称量(mg)
4.0 5.0(NaOH溶解) 5.0(NaOH溶解)
1000 20
（五）、生长调节物质（激素）母液的配制（浓度1mg/ml）
激素的使用比较灵活，要根据培养的植物种类和目的而定。为了操作方便，节约时间，激素也可如同配制上述母液一样，先配成浓缩母液（1mg/ml），这样配制培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。
生长调节物质一般不溶于水，可先用少量不同的溶剂来溶解。例如，萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA）,赤霉素（GA3），2，4-D等生长素和玉米素（Ze）可先用少量95%酒精助溶，然后再加蒸馏水定容至刻度。激动素（KT）和6-苄基嘌呤（6-BA）可先溶于少量1mol/L的盐酸中，叶酸需用少量稀氨水溶解（见附表2）。
用电子天平分别称量各种生长调节物质50mg，并先用相应的少量有机溶剂进行助溶，再加蒸馏水定容至50ml，可得到浓度为1mg/ml的生长调节物质母液,即配制的母液每毫升含有生长调节物质1.0mg。贴好标签，写明配制的激素浓度，存于冰箱保存（0~4℃）。
配制培养基时，如每升（1000ml）需添加的生长调节剂物质为0.5mg时，则取0.5ml母液即可。
注意：各种母液配制好后应存放在4℃冰箱中，使用中防止污染和沉淀（贮存温度过低时会产生针状结晶），发现有沉淀或霉团时，则不能继续使用。 五、实验报告
1、将本次实验内容整理成实验报告。 2、制备母液时应注意哪些问题？为什么？
3、根据所给母液浓度、蔗糖、琼脂用量、PH值，按MS配方计算各种母液吸取量，填入下表：
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组织培养实验指导书
