MiR-18a通过靶定ATM调节白血病细胞HL-60对VP-16和VCR化疗敏感性
肖悦1，胡蓉2*
【摘 要】摘要：目的:研究miR-18a调控白血病细胞HL-60对VP-16和VCR化疗敏感性的分子机制。方法：构建稳定过表达miR-18a的HL-60-pcDNA3.1-miR-18a细胞系，检测其对VP-16和VCR的敏感性；构建ATM 3′UTR区的荧光素酶报告载体，验证miR-18a对ATM的靶向作用；Western blot检测过表达miR-18a的HL-60细胞内ATM的表达水平；siRNA敲减HL-60细胞中ATM水平，CCK-8检测细胞对VP-16和VCR的敏感性；在稳定过表达miR-18a的HL-60细胞内转染miR-18a inhibitor，Western blot检测ATM的表达水平，并检验细胞对VP-16和VCR的敏感性变化。结果：过表达miR-18a后，用相同浓度的VP-16和VCR处理时HL-60细胞存活率降低；荧光素酶活性检测表明，miR-18a能够抑制ATM的荧光素酶活性；过表达miR-18a后HL-60细胞内ATM的表达降低；敲减ATM后的HL-60细胞经VP-16和VCR处理后存活率降低；转染miR-18a inhibitor后，ATM表达水平显著上调，经VP-16和VCR处理的细胞存活率明显高于对照组。结论：miR-18a能够通过靶定ATM而调控白血病细胞HL-60对VP-16和VCR的敏感性。
【期刊名称】中国实验血液学杂志 【年(卷),期】2015(023)004 【总页数】6
【关键词】miR-18a；ATM；白血病；VP-16；VCR
·论著·
J Exp Hematol 2015; (4):999-1004
白血病(leukemia)，是一类造血干细胞恶性克隆性疾病。近年来的研究表明，微小RNA(microRNA或miRNA)与包括白血病在内的多种癌症的发生发展密切相关[1-4]，有的miRNA可通过对其靶基因的调控作用，而对多种肿瘤的易感性或对药物的敏感性产生重要影响[5]。研究显示，miR-18a在直肠癌、胃癌、前列腺癌等多种癌症中均有差异性表达，并在一定程度上影响了肿瘤细胞对药物的敏感性[6-8]，但关于miR-18a在白血病中对药物敏感性的影响机制还未见报道。VP-16(Etoposide)中文名为足叶乙甙，又名鬼臼乙叉甙，是一种细胞周期特异性的抗肿瘤药物，可作用于细胞周期的S期晚期或G2期。VCR又名长春新碱，也是现今临床常用的肿瘤治疗药物之一，VP-16和VCR现已应用于白血病治疗的相关研究中[9-10]，但关于白血病细胞对药物敏感性作用机制的研究尚未明确。本研究旨在验证miR-18a能否调控白血病细胞HL-60对VP-16及VCR化疗药物的敏感性，并探索其发挥作用分子机制，为白血病的化疗提供新的思路。
材料和方法
细胞系及主要试剂
人白血病细胞系HL-60购于上海中科院细胞库；RPMI 1640细胞培养液、OPTI-MEM购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司；转染试剂
LipofactamineTM2000、LipofectamineTMRNAiMAX
购自美国
Invitrogen公司；CCK-8购自日本同仁化学研究所；双荧光素酶检测试剂盒购自美国Promega公司；miR-18a mimics、miR-18a inhibitor购置于广东瑞
博；ATM siRNA、control siRNA均购买于上海吉玛技术制药有限公司；反转录酶及实时定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；兔抗人ATM、β-actin多克隆抗体以及羊抗兔二抗购自美国Abcam公司；VP-16、VCR购自深圳万乐药业有限公司，G418购自美国Sigma公司。 细胞培养
白血病细胞HL-60用10%的RPMI 1640培养液置于37 ℃、5% CO2 饱和湿度的细胞培养箱培养。 质粒构建
用Primer 5.0设计引物，在美国Invitrogen公司合成，以正常细胞的基因组为模板对miR-18a序列进行PCR扩增，引物序列如下：上游引物：5′-TGGATC CTGTTCTAAGGTGCATCGC-3′(BamH1)； 下游引物：5′-TGAATTCTGCCAGAAGGAGCACTGG-3′(EcoR1)，琼脂糖凝胶电泳分离相应大小的基因片段，切胶回收，得到目的扩增片段后，酶切质粒及PCR产物并回收，进行酶切产物连接。随后进行感受态转化、涂平板、挑菌、小摇及菌落PCR鉴定及测序。测序正确的即可大扩增菌液提取质粒。 细胞转染
取对数生长期的HL-60细胞，以0.8×107个/ml接种于6孔板中，1 ml/well，于37 ℃、5% CO2条件下培养。18 h后换成无血清培养液，以LipofectamineTMRNAi MAX为转染试剂转染ATM siRNA(正义序列：5′-GUGAUAGAUAACAACGAUATT-3′
；
反
义
序
列
：
5′-
UAUCCUUGUUAUCUAUCACTT-3′；)以LipofactamineTM2000为转染试剂进行质粒传染。转染6 h后换为新鲜完全培养液继续培养。
稳定过表达miR-18a的HL-60细胞HL-60-pcDNA3.1-miR-18a克隆的筛选 转染质粒pcDNA-3.1-miR-18a及pcDNA-3.1空载48 h后，将培养液换为含2 μg/ml的G418的完全培养液，筛选2周，得到稳定过表达miR-18a的HL-60细胞株。
RNA提取和Real-time PCR
用TRIzol提取细胞总RNA，应用Nano-Drop分光光度仪进行RNA浓度测定，琼脂糖凝胶电泳鉴定提取的RNA的质量。应用特异的miR-18a的反转录引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCG
CACTGGATACGACGCCAAT-3′；用U6作为内参，引物序列：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTA
TTCGCACTGGATACGACAAAAATATG-3′，以反转录产物cDNA为模板，进行Real-time
PCR
，
其
中
miR-18a；
U6
上上
游游
引引
物物
：：
5′-5′-
GATAGCAGCACAGAAATATTGGC-3′
GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3′，通用下游引物：5′-GTGCAGGGTCCGAGG-3′总反应体系20 μl，其中cDNA 1 μl、上下游引物 各1 μl、SYBR荧光染料10 μl、ddH2O 7 μl，反应程序为95 ℃，2 min；95 ℃，15 s，60 ℃，45 s；40个循环。
HL-60细胞对VP-16及VCR敏感性的CCK-8检测
取对数生长期的HL-60细胞，以0.8×105个/ml接种于96孔板中，100 μl/well，于37 ℃、5% CO2条件下培养。20 h后，用VP-16及VCR处理，浓度设置为10、 1、 0.1、0.01、 0.001 ng/ml，处理48 h后，将旧培养液吸去，置换含10% CCK-8的新鲜培养液于37 ℃，5% CO2条件下继续培养，
3 h后，检测450 nm吸光度值。 荧光素酶报告载体的构建
在miRbase中找出可能与miR-18a作用的ATM的3'UTR序列，用Primer 5.0软件分别设计合成野生型与突变型ATM的3′UTR的PCR引物。引物序列：野
生
型
(wild
type)ATM
3′UTR
区，
上下
游游
引引
物物
：：
5′-5′-
CGGATCCTAATTGCACCTTAATGG-3′(Sac1)
CCTCGAGAATTCAGGTAACAGTAAAG-3′(Xh-o1)， 突变型(mutation type,mut)ATM 3′UTR区上游引物：5′-CGGATCCTAATTCGTGCAATATGG-3′(Sac1)，下游引物：5′-CCTCGAG5′-CCTCGAGAATTCAGGTAACAGTAAAG-3′(Xho1)。以白血病细胞HL-60 cDNA为模板进行PCR扩增。PCR产物纯化回收后与连接到pMIR-REPORT载体上，经测序鉴定得到野生型与突变型荧光素酶报告载体：wt-ATM-pMIR-REPORT与mut-ATM-pMIR-REPORT。测定wt/mut-ATM-pMIR-REPORT(A1)和海肾荧光素酶表达载体(A2)的活性， A1/A2比值表示相对荧光素酶活性。 荧光素酶活性测定
将构建好的wt-ATM-pMIR-REPORT与mut-ATM-pMIR-REPORT报告载体分别与miR-18a mimic共转染到HL-60细胞中，以mimic control为对照，转染48 h后裂解细胞，用双荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶活性。实验每组设3个平行，重复3次。 Western blot检测蛋白表达水平
将转染48 h处理后的细胞用PBS清洗，使用裂解液RIPA(50 mmol/L Tris-HCl pH 7.2，150 mmol/L NaCl，1% TritonX-100和0.1% SDS)裂解后提取
MiR-18a通过靶定ATM调节白血病细胞HL-60对VP-16和VCR化疗敏感性
