第五章
蛋白质川：蛋白质的性质、分离与鉴定 第一节蛋白质性质
一、 蛋白质的酸碱性质 蛋白质等电点（pl）
溶解度最小
二、 蛋白质分子的大小
KD， kd，kD，kDa （ kilodalton） 寡聚蛋白质
（oligometric protein） 超分子复合物（supramolecular complex）
蛋白质分子量可粗略估计（AA平均分子量约为110 dalton） 三、 蛋白质的胶体性质 质点范围：1-100 nm 蛋白质胶体系统稳定的原因：
水化层（hydration mantle） 双电层（electric double layer） 第二节 蛋白质的分离纯化 一、 蛋白质分离提纯的一般原则 高纯度、高活性、高回收率 二、 蛋白质的分离方法
（一） 根据分子大小不同的分离方法 1. 透析（dialysis）和超滤（ultrafiltration）
半透膜（玻璃纸，火棉纸） 透析常用于蛋白质溶液的除盐 超滤常用于蛋白质溶液的除盐、浓缩
3. 凝胶过滤（gel filtration chromatography）
分子筛层析，分子排阻层析
交联葡聚糖
（Sephadex）
聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-Gel P）
琼脂糖凝胶 （Sepharose, Bio-Gel A）
凝胶过滤原理
根据蛋白质分子大小用凝胶作为介质分离蛋白质的一种 柱层析方法。
比凝胶网孔大的分子被排阻在凝胶颗粒外， 而最先流出柱
外；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶颗粒的内 外，
洗脱路径长，因而得到分离。 （二） 利用溶解度差别的分离方法 1. 等电点沉淀 2. 蛋白质的盐溶与盐析 3. 有机溶剂分离法
4. 温度对蛋白质溶解度的影响 （三） 根据电荷不同的分离方法 1 电泳（electrophoresis）
在一定的电场和介质中，蛋白质迁移速度与蛋白质 _________ 量、所带电荷及分子形状有关。 迁移率=某一蛋白条带移动距离 /前沿到达距离
a.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
丙烯酰胺和交联试剂（甲叉双丙烯酰胺）在过硫酸铵催 化下聚合而成。
可以控制孔径大小
b. 不连续电泳（discontinuous electrophoresis
凝胶孔径（浓缩胶，分离胶）、缓冲液、pH 三种效应：电荷效应、分子筛效应、浓缩效应 c. 毛纟田管电泳（capillary electrophoresis）
50 'm内径 d. 等电聚焦电泳（IFE）
蛋白质在具有 pH梯度的介质中进行分离。 在电场中，每 种蛋白质成分将移向并停留在等于其等电点的 pH处，形
成一个很窄的区带。 用途：按等电点分离蛋白质
鉴定蛋白质等电点
2.
离子交换柱层析
（ion-exchange chromatography ） 纤维素离子交换剂
阳离子交换剂：CM-Cellulose（羧甲基纤维素） 阴离子交换剂：DEAE-Cellulose
葡聚糖离子交换剂（Sephadex ion exchanger） 兼分
子筛效应
（四） 根据蛋白质的吸附特性分离 填料有：
羟基磷灰石、活性碳、
硅胶、氧化铝等
（五） 利用特异生物学亲和力纯化
利用蛋白质所具有的生物学特异性，通过与特异配基专 一、可逆结合（非共价结合）分离蛋白质的一种层析方法。 优点：高效、高纯
亲和层析（afinity chromatography ） 快速蛋白液相层析
fast protein liguid chromatography（FPLC）
思考题
蛋白质胶体稳定性的原因 凝胶过滤、离子交换柱层析的原理 电泳原理 亲和层析、盐析 蛋
白 质 分
离 可 分
别 根 据
其 ________________ 、 ______________ 、 ______________ 、 性质进行。
蛋白质在电泳胶上的迁移率与蛋白质分子 _______________ 、 禾廿 __________ 有关。
不连续电泳分离效果好是因为它同时具 有 、 、 三个效应。 DEAE-cellulose 是一种 ___________________ 。 蛋白质混合物经凝胶过滤后，大分子先于小分子被洗脱。 （）
盐析和透析均可用于蛋白质除盐。 （） 羧甲基纤维素属于阳离子交换剂。
（）
第三节蛋白质的鉴定 一、蛋白质分子量的测定
（一） SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS- PAGE 变性电泳
在巯基乙醇存在下，
蛋白质亚基分开，多肽链伸展；然
后SDS与多肽链以1.4:1的重量比结合成复合物。
SDS与蛋白质的结合改变了蛋白质分子的带电情况和分 子形状 因此当蛋白质在电场中移动时，其迁移率仅与其分子量有 关。 蛋白质分子量M与迁移率的关系式:
用已知分子量的标准蛋白在同样条件下电泳，
分别测其迁
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It 6,250
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Bovine scrum albumin
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M r
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移率，做成标准曲线。
测出未知蛋白质的迁移率，从图上查得蛋白质分子量。 SDS-PAGE测定蛋白质分子量的特点：
蛋白质已变性； 对多亚基蛋白，测定的是亚基的分子量。 （二） 凝胶过滤
蛋白质分子量与洗脱体积关系式：
Log M = k1-k2Ve
标准蛋白洗脱曲线
测出未知蛋白质的洗脱体积，从图上查出蛋白质分子量。 特点：
测的是天然蛋白质分子量； 适合球状分子。 （三） 沉降速度法
蛋白质在离心力作用下发生沉降， 沉降速度与蛋白质分子 分子量、密度、形状有关。
对特定蛋白质来讲，单位离心力场的沉降速度为一定值， 称为沉降系数（ sedimentation coefficient）。 沉降系数通常用 Svedberg单位（S）表示。 一个S等于10-13秒。
斯维得贝格（Svedberg）方程：
分子量越大。
沉降系数越大
（四）蛋白质分子量测定新技术 1. Recombinant DNA technology 2. Electrospray Mass Spectrometry 二、 蛋白质纯度的鉴定 （一） 电泳一条带 （二） 沉降分析图谱一个峰 （三） 溶解度曲线一个折点 （四） 结晶
三、 蛋白质含量的测定 1. 凯氏定氮法 2. 双缩脲法
3. Folin-酚法（Lowry 法） 4. 考马斯亮蓝法
5. 紫外吸收法
四、 蛋白质免疫印迹分析
（immunoblot，western blot） （一）原理
蛋白质的凝胶电泳分离； 抗原航体间的特异结合
Anti ni- Am<.iprTi- binding isi
bindln^
L*±
V = VM.riu.ljlt? doEiistixi 11. JLi =
(T) Coat surface with sample IX ■ M (antigens).
Block unoccupied wite辱 with
nonspecific protein
Inuuhsit■匚 with primary antibody against spi>ci fic nrit igcn.
IncuHrite? with
anti body-enzyme complex that binds primary antibody.
适) A.dd. su batrat tx
(G^) F'orni ation of colored product indiczLtcs
presence of sipecifie iinti^en.
Use an electrical field to transfer proteins from the gel to membrane.
Labeled molecule bound
to antibody Antibody
,\\P-. ■
Wash av^ay unbocird antibodies.
Use tiuofescent or ractioactiveiy labeled antibodies TQ tderitify proteirs of interest.
Protein bound to membrane
Western blot技术要点： 用途：定性蛋白质
蛋白质表达水平
测定混合样品中某蛋白的分子量 抗体的特异性
常见蛋白质脱盐方法：
透析 凝胶过滤
有机溶剂、有机酸沉淀 常见浓缩蛋白质的方法
盐析 超过滤 等电沉淀 冷冻干燥
聚乙二醇法
课堂讨论：
下述结论对不对，为什么？
1. 某蛋白质样品，SDS-PAGE分析出现2条带，表明该 样品一定不纯。
2. 某蛋白质样品，PAGE分析仅1条带，表明该样品很 纯。 习题
蛋白质浓缩的方法
SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理 凝胶过滤测定蛋白质分子量的原理 名词解释：沉降系数、免疫印迹
生物化学考研资料
