第二十一章 常用分子生物学技术的原理及其应用.

第二十一章 常用分子生物学技术的原理及其应用 第一节 基因工程 一、基因工程的基本概念

将目的基因与载体 DNA 连接起来再导入宿主细胞, 并对目的 DNA 片段 作选择性扩增和表达。 其中将基因进行克隆, 并利用克隆的基因表达、 制 备特定的蛋白质或多肽产物, 或定向改造细胞乃至生物个体的特性所用的 方法及相关的工作统称为基因工程。

二、工具酶

(一 限制性核酸内切酶 1. 限制性核酸内切酶的概念 2. 限制性核酸内切酶的命名

3. 限制性核酸内切酶的识别和切割位点 (二其它工具酶 1.DNA连接酶 2.DNA聚合酶 3.逆转录酶 4.多核苷酸激酶 5.碱性磷酸酶

6.末端脱氧核苷酸转移酶 三、载体

(一质粒 (二噬菌体 (三粘粒 (四病毒

四、重组 DNA 技术的基本原理

基因工程中最主要的工作是进行分子克隆,即制备 DNA 片段,通过载 体将其导入受体细胞, 在受体细胞中复制、 扩增, 以获得单一 DNA 分子的大 量拷贝。

(一重组 DNA 技术的基本过程 1、目的基因的制备 1 基因组 DNA 文库 2 制备 cDNA 文库 3 聚合酶链反应 4化学合成

2.目的基因与载体的连接 1粘性末端连接 2同聚物加尾连接 3平行末端连接 4人工接头连接

3.将外源 DNA 导入宿主细胞

1 . 转化:指将质粒或其它外源 DNA 导入处于感受态的宿主细胞,并使其 获得新的表型的过程。

2 . 感染:是以噬菌体进入宿主菌或病毒进入宿主细胞中繁殖的过程。 4.目的基因的筛选和鉴定

1 . 遗传学方法:针对载体携带有某种或某些标志基因和目的基因而设计 的筛选方法。

2 . 分子杂交方法:利用 32P 标记的探针与转移至膜上的重组 DNA 或克隆的 DNA 片段进行分子杂交,直接筛选并鉴定目的基因。

3 . 免疫学方法:利用特异性抗体与目的基因表达产物特异结合的方法筛 选。 5.克隆基因的表达

产生 mRNA 和合成目的基因的蛋白质产物。 五、基因工程在医学中的应用 (一医学基础研究

建立人类染色体的基因文库, 为进一步寻找基因、 分析基因序列奠定 基础。 (二疾病诊断和治疗 (三基因工程药物

①利用基因工程技术改造传统的制药工业 ②利用克隆表达的基因生产药用肽类和蛋白质 (四转基因动植物

转基因动物在医学上可用作特定的实验模型,还可以用于生产药用 蛋白质。甚至可用于器官移植。

(五人类基因组计划

人类基因组计划的目标就是分析人类基因组 DNA 的全部核苷酸序 列,识别所有基因的编码序列,确定基因的位置及其功能,与人类遗传 病相关的致病基因的定位、克隆、功能研究和测序等发现新基因、探明 疾病发病机制、预见发病风险和诊断疾病。

(六蛋白质工程

按照人们的设想和构思,通过基因改造来改变蛋白质的结构。 第二节 核酸分子杂交技术

一、核酸分子杂交的基本原理 二、核酸分子杂交的基本方法 (一 Southern 印迹杂交 (二 Northern 印迹杂交 (三斑点及狭缝杂交 (四原位杂交 三、探针的标记 (一探针的特征 (二探针的种类和制备 1.基因组 DNA 探针

2.cDNA探针 3.寡核苷酸探针 4.RNA探针 (三探针的标记物 1.放射性核素标记物 2.非放射性核素标记物 (四标记方法 第三节 聚合酶链反应 一、 PCR 的基本原理 加热变性 退火 延伸

二、 PCR 的基本反应 (一以 DNA 为模板的反应

(二以 mRNA 为模板的反应—— RT-PCR (三 PCR 产物的积累规律 三、 PCR 的应用

1. RT-PCR 用于分析基因转录产物,构建 cDNA 文库 2. 用于 mRNA 的检测、调控元件的分析