第1讲 无菌操作技术
[考纲展示] 1.微生物的分离和培养 2.某种微生物数量的测定 3.培养基对微生物的选择作用
考点一| 微生物的分离和培养
1．相关技能、技术和方法 (1)无菌操作的技能——灭菌
①分类：实验室常用高温处理达到灭菌效果，包括干热灭菌和湿热灭菌。 ②作用：微生物分离和培养的基础。 ③关键：防止外来杂菌的入侵。 (2)配制培养基 ①培养基概念：
为人工培养微生物而制备的适合微生物生长、繁殖或积累代谢产物的营养物质。 ②分类：按化学性质的不同分为天然培养基和合成培养基。 (3)接种微生物
①接种：指在无菌条件下将微生物接入培养基的操作过程。 ②接种方法和常用工具(连线) 接种方法 常用工具 Ⅰ.涂布平板接种 a．接种针 Ⅱ.穿刺接种 b．接种环 Ⅲ.斜面接种 c．玻璃涂布器 Ⅳ.平板划线接种
答案：Ⅰ－c Ⅱ－a Ⅲ－b Ⅳ－b 2．大肠杆菌的接种与分离培养 (1)配制牛肉膏蛋白胨培养基
其操作步骤：配制培养基→调节pH→分装→包扎→灭菌→搁置斜面。 (2)斜面接种和培养大肠杆菌
①主要目的：菌种转移、扩大培养和保存纯净菌种等。
②主要步骤：准备接种→接种环灭菌→试管口灭菌→挑取少许菌种→划线接种→在37_℃恒温箱中培养大肠杆菌24 h→将增殖的菌种放置在冰箱的冷藏室中(4 ℃)保存。
(3)平板划线分离和培养大肠杆菌
①平板的作用：培养、分离细菌等微生物。
②平板划线法是指用带有微生物的接种环在平板培养基表面通过分区划线而纯化分离微生物的一种方法。
[思考回答]
1．微生物接种的核心是什么？
提示：防止杂菌污染，保证培养物的纯度。
2．如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请分析接种的具体方法。
(1)获得图A和图B效果的接种方法分别是什么？
提示：图A效果是稀释涂布平板法，图B效果是平板划线法。
(2)某同学在用A方法纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是什么？为了防止杂菌污染，有同学建议加入抗生素，你觉得可以吗？并说明理由。
提示：菌液浓度过高(土壤溶液稀释不够)。不可以，因为抗生素不但杀灭杂菌，而且也可以杀灭大肠杆菌，因此在培养基上不可以加入抗生素。
1．选择无菌技术的原则
(1)考虑无菌技术的效果：灭菌的效果比消毒要好。
(2)考虑操作对象的承受能力：活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒，而不能灭菌。 2．微生物的培养基 (1)培养基的成分 营养要素 无机碳源 碳源 有机碳源 来源 功能 CO2、NaHCO3、CaCO3等含碳无机物 a.构成细胞物质和一些代谢产糖类、脂质、蛋白质、有机酸、石油、花生粉饼等 无机氮：NH3、铵盐、硝酸盐、N2等 牛肉膏、蛋白胨、核酸、尿素、氨基酸 维生素、氨基酸、碱基 a.酶和核酸的组成成分 合成蛋白质、核酸及含氮的代谢产物 物 b.既是碳源又是能源(有机碳源) 氮源 无机氮源 有机氮源 生长因子
b.参与代谢过程中的酶促反应 水 培养基、大气、代谢产物 不仅是良好的溶剂，还是结构物质 细胞内的组成成分，生理调节物无机盐 培养基、大气 质；某些化能自养型细菌的能源；酶的激活剂 (2)根据理化性质对培养基的分类 物理性质 种类 液体培养基 固体培养基 特点 不加凝固剂 加凝固剂 含化学成分不明的天然物质 培养基成分明确或用一定化学物质配制 应用 工业生产 微生物的分离、鉴定、活菌计数、保藏 工业生产 化学成分 天然培养基 合成培养基 分类、鉴定 (3)根据功能可分为选择培养基和鉴别培养基 类型 实例 培养基中加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌 培养基中加入高浓度的食盐用于分离得到金黄色葡萄球菌 以尿素作为唯一氮源的培养基用于分离分解尿素的细菌 选择培养基 不添加氮源的培养基用于分离固氮微生物 石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的 培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物 鉴别培养基 伊红—美蓝培养基可以鉴别大肠杆菌(菌落呈黑色)
◎考法1 考查无菌技术和培养基成分及分类 [解题指导] 关于培养基的理解
1．(2019·江西赣中南五校第一次联考)下表是某公司研发的一种培养大肠杆菌菌群的培养基配方，请根据表格和所学知识回答下列相关问题。
成分 含量(g) 蛋白胨 10.0 乳糖 5.0 蔗糖 5.0 K2HPO4 2.0 指示剂 0.2 琼脂 12.0 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL (1)从生态系统的成分上看，大肠杆菌属于__________。 (2)若根据用途划分，该培养基属于__________(填“选择”或“鉴别”)培养基。若要用上述培养基来筛选出土壤中的尿素分解菌，培养基的营养成分必需怎样更改？________________，并用__________作为指示剂。
(3)在微生物培养的过程中，为防止杂菌污染，需要对培养基和培养皿进行__________；操作者的双手需要进行清洗和__________。
(4)图1和图2是培养某细菌的结果图，其对应的接种方法分别是：______________和______________，这两种方法接种后培养基上都可以得到由单个细胞繁殖所形成的__________。
图1 图2
解析：(1)大肠杆菌只能从环境中摄取有机物，不能自己合成有机物，属于分解者。(2)该培养基中含有指示剂，属于鉴别培养基。尿素分解菌可以分解尿素，而其他微生物不能，因此可将培养基中的蛋白胨改为尿素用于筛选土壤中的尿素分解菌，并用酚红作为指示剂，尿素分解菌分解尿素产生了NH3可使酚红变红。(3)培养微生物时，培养基和培养皿需要灭菌，操作者双手需要进行消毒。(4)图1采用的是稀释涂布平板法，图2采用的是平板划线法。单个微生物细胞繁殖所形成的细胞群叫菌落。
答案：(1)分解者 (2)鉴别 将蛋白胨改成尿素 酚红 (3)灭菌 消毒 (4)稀释涂布平板法 平板划线法 菌落
2．某研究小组研究了不同浓度的抗生素A对大肠杆菌生长的影响，实验结果见如图1。回答下列相关问题：
(1)该培养基为大肠杆菌提供的主要营养物质有碳源、水、无机盐、________四类，而配置该培养基时，通常加入________作为凝固剂。
(2)为了确保利用________________法接种大肠杆菌时，形成一层菌膜，则对菌种的稀释倍数________。另外，在培养和接种大肠杆菌时要特别注意进行__________操作。根据实验结果，选出对大肠杆菌抑制作用最明显的抗生素A浓度的依据是
_________________________________________________________________ ________________________________________________________________。 (3)为减少实验误差，每一浓度的抗生素A还要制备________。
(4)该研究小组运用上述实验方法还研究了相同浓度的a、b、c三种不同抗生素对大肠杆菌生长的影响。请在图2中图示这一处理方案(可模仿图1加以必要的注解)。
解析：(1)微生物生长繁殖所需要的四类主要营养物质是水、无机盐、碳源和氮源。该实验所用的培养基为固体培养基，常用的凝固剂是琼脂。
(2)图中接种大肠杆菌时所使用的接种方法是稀释涂布平板法，为了得到菌膜，稀释倍数不能太大。接种和培养大肠杆菌的关键是无菌操作。据图1分析，⑤号圆纸片的抑菌圈最大，说明该浓度的抗生素A对大肠杆菌抑制作用最明显。
(3)为减少实验误差，每一浓度的抗生素A还要制备多个圆纸片进行重复实验。 (4)该方案的自变量为相同浓度的a、b、c三种不同抗生素，还应有空白对照，注意在图中要标记清楚，具体图解见答案。
答案：(1)氮源 琼脂 (2)稀释涂布平板 不能太大 无菌 透明圈越大，抑制效果越明显 (3)多个圆纸片 (4)图示见如图所示
◎考法2 考查微生物的分离和培养
3．(2014·全国卷Ⅱ)为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：
(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是
2020版高考生物复习第1讲无菌操作技术教学案苏教版(选修1)
