南方农业学报JournalofSouthernAgriculture2020，51（7）：1684-1692·1684·南方农业学报ISSN2095-1191；CODENNNXAABhttp://www.nfnyxb.com51卷DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2020.07.022基于mtDNACOI和mtDNACOII分子标记的
贵州省茶棍蓟马种群遗传多样性分析
2
罗林丽1，，孟泽洪3，李
2222*
帅3，赵兴丽1，，周罗娜1，，贺圣凌1，，周玉锋1，
（1贵州省农业科学院生物技术研究所，贵阳
3
550006；2贵州省农业生物技术重点实验室，贵阳
550006）
550006；
贵州省农业科学院茶叶研究所，贵阳
摘要：【目的】研究贵州省茶棍蓟马不同地理种群间的遗传多样性，为掌握贵州省茶棍蓟马的遗传动态和扩散规律及制定防控措施提供理论依据。【方法】以贵州省11个不同地理区域的茶棍蓟马种群mtDNACOI和mtDNACOII基因序列为靶标，利用MEGA6.0、DnaSP5.10、Arlequin3.5.2.2和Network2.0等软件对种群遗传分化、基因流水平、分子变异及种群遗传多样性等进行分析。【结果】基于mtDNACOI和mtDNACOII基因分析时，分别检测到11种和9种单倍型，各地理种群的单倍型多样度（Hd）较高，分别为0.609和0.633；总体遗传固定指数（FST）分别为0.11902和0.09052，基因流（Nm）分别为2.00和2.51，表明贵州省茶棍蓟马各地理种群间的基因交流水平较高，种群间遗传分化较小。mtDNACOI和mtDNACOII基因序列的单倍型网状树分析均无明显分支；种群间的分子变异（AMOVA）分析结果表明，茶棍蓟马的遗传变异主要来自种群内部。总群体的中性检验Fu’sFs不显著（P>0.05），且错配分布曲线呈现多峰，说明贵州省茶棍蓟马种群在较近的历史时期内保持相对稳定，未经历明显的种群扩张，或处于临界状态。【结论】贵州省茶棍蓟马种群遗传多样性较丰富，虽然尚未形成明显的种群扩张，但可能已处于临界状态，应积极采取综合防控措施，力争将茶棍蓟马种群数量控制在危害水平以下，以保证贵州省茶产业生产健康可持续发展。
关键词：茶棍蓟马；mtDNACOI基因；mtDNACOII基因；地理种群；遗传多样性中图分类号：S433.89
文献标志码：A
文章编号：2095-1191（2020）07-1684-09
GeneticdiversityamongpopulationsofDendrothripsminowai
PriesnerinGuizhoubasedonmtDNACOIand
mtDNACOIImolecularmarkers
222
LUOLin-li1，，MENGZe-hong3，LIshuai3，ZHAOXing-li1，，ZHOULuo-na1，，
22*
HESheng-ling1，，ZHOUYu-feng1，
2
（1InstituteofBiotechnology，GuizhouAcademyofAgriculturalSciences，Guiyang550006，China；KeyLaboatoryof
AgriculturalBiotechnology，GuizhouAcademyofAgriculturalScience，Guiyang550006，China；3
TeaResearchInstitute，GuizhouAcademyofAgriculturalSciences，Guiyang550006，China）
Abstract：【Objective】Thestudywasconductedtoinvestigategeneticdiversityamongdifferentgeographicalpopula-tionsofDendrothripsminowaiPriesnerinGuizhou，soastoprovidetheoreticalfoundationfortheanalysisofpopulation
geneticdynamics，populationdispersionmechanismandformulatingcontrolmeasures.【Method】ThemtDNACOIandmtDNACOIIsequencesofD.minowaipopulations，whichcollectedfrom11differentgeographicalareasinGuizhou，wereselectedasmolecularmarkers，populationgeneticdifferentiation，geneflow，molecularvarianceandgeneticdiver-sityofpopulationswereanalyzedbyusingsoftwareMEGA6.0，DnaSP5.10，Arlequin3.5.2.2，Network2.0etc.【Re-sult】Atotalof11and9typesofhaplotypeweredetectedwhenthemtDNACOIandmtDNACOIIgenewereanalyzed，respectively，haplotypediversity（Hd）ofdifferentgeographicpopulationwerehigh，whichwere0.609and0.633，respec-tively.Thetotalgeneticfixationsindex（FST）were0.11902and0.09052，thetotalgeneflow（Nm）were2.00and2.51，re-spectively，whichindicatedthatthelevelofgenecommunicationwashighandthegeneticdifferentiationamongpopula-tionsweresmall.ThehaplotypenetworkofdifferentgeographicalpopulationsbasedonmtDNACOIandmtDNACOIIshowednoobviousbranches，andtheanalysisofmolecularvariance（AMOVA）ofdifferentgeographicalpopulationsindi-catedthatthegeneticvariationmainlyoccurredwithinthesamepopulation.ThetotalneutraltestshowedthatFu’sFswerenotsignificant（P>0.05），andthemismatchdistributioncurvehadmultiplepeaks，whichindicatedthepopulationof收稿日期：2020-05-18基金项目：国家自然科学基金项目（31560515）；国家现代农业产业技术体系建设专项（CARS-19）；贵州省科技计划项目（NY〔2015〕
3011-2号）
作者简介：*为通讯作者，周玉锋（1971-），研究员，主要从事植物病虫害防控研究工作，E-mail：gzzhouyf@163.com。罗林丽
（1991-），主要从事植物病虫害与分子生物学研究工作，E-mail：linli_luo@126.com
7期罗林丽等：基于mtDNACOI和mtDNACOII分子标记的贵州省茶棍蓟马种群遗传多样性分析
·1685·D.minowaiinGuizhouwererelativelystableinrecenthistoricalperiod，andhasnotexperiencedevidentexpansionoratcriticalstate.【Conclusion】ThegeneticdiversityofD.minowaipopulationsinGuizhouisrelativelyrich，whichhasnotyetformedanobvioussuddenexpansion，butmightapproachtocriticalphase.Therefore，comprehensivepreventionandcontrolmeasuresshouldbetakenactivelytocontroltheD.minowaipopulationsquantityunderdamagelevelandensurethesustainableandhealthydevelopmentofteaproductioninGuizhou.
Keywords：DendrothripsminowaiPriesner；mtDNACOIgene；mtDNACOIIgene；geographicalpopulation；ge-neticdiversity
Foundationitem：NationalNaturalScienceFoundationofChina（31560515）；NationalModernAgriculturalIndus-tryTechnologySystemConstructionProject（CARS-19）；GuizhouScienceandTechnologyPlanProject（NY〔2015〕3011-2）
0引言
【研究意义】茶棍蓟马（DendrothripsminowaiPriesner）又称茶棘皮蓟马，属缨翅目（Thysanoptera）蓟马科（Thripidae）（唐美君和肖强，2018），在我国主要分布于浙江、福建、广东、广西、海南和贵州等南方茶区，在山东等也有少量报道（王洪涛等，2018；李貌等，2020）。近年来，茶棍蓟马在贵州省多地为害且逐年加重，个别区域暴发成灾，严重影响茶叶的产量和品质，成为影响贵州省茶叶生产的主要害虫之一2013；吕召云等，2015）。贵州省地貌以山地居多，受多种因素的影响，气候呈现多样性，生物多样性及群体遗传多样性也极其丰富，在此基础上探索茶棍蓟马种群内在的遗传变异与进化关系等，能从遗传学角度为有效防控茶棍蓟马提供理论指导。【前人研究进展】目前，针对蓟马遗传多样性的研究多集中在入侵性害虫西花蓟马上。武晓云等2009）利用PCR克隆并分析了西花蓟马rDNAITS2和mtDNACOI基因序列的进化速率，发现rDNAITS2序列的变异程度比mtDNACOI高，提出mt-DNACOI较rDNAITS2更适合应用于西花蓟马的种内遗传分析；Brunner和Frey（2010）利用mtDNACOI基因和微卫星分子标记对美国西部地区西花蓟马种群的遗传结构进行分析，发现在起源地西花蓟马种群发生了分化，且这种遗传分化与形态上的分化不一致，推测这种分化是由栖息地的环境不同（地理隔离）造成；乔玮娜（2012）运用DNA条形码技术对我国13个省（市）不同地理种群西花蓟马的175条mt-DNACOI基因序列进行遗传多样性和遗传分化程度分析，推测我国西花蓟马各地理种群的可能来源；Yang等（2012a，2012b）用微卫星和mtDNACOI分子标记研究西花蓟马在我国的入侵遗传学，发现传入我国的西花蓟马在遗传多样性上表现出一个明显的瓶颈效应，揭示西花蓟马可能首先传入我国云南，随后云南成为我国其他西花蓟马种群的源头。沈登荣等（2014）对蓟马科9个属27种的mtDNA-COI基因序列变异进行分析，首次报道了茶棍蓟马的mtDNA-COI基因序列。目前茶棍蓟马虽然已在贵州等多地
为害，但其研究仅限于形态（王洪涛等，2018）、空间分布（张莉等，2019）和防治措施（赵志清和陈流光，1998；李慧玲等，2014；涂娟等，2016；董照锋和张小平，2018；曾明森，2019）等方面，鲜少有利用分子标记技术探讨茶棍蓟马遗传变异方面的相关研究，仅Lü等（2016）利用mtDNACOI作为分子标记研究了贵州茶棍蓟马的遗传结构与多样性，认为贵州省茶棍蓟马种群在近期发生了种群扩张。【本研究切入点】线粒体基因已广泛运用于动物（尤其是昆虫）分子进化与系统发育研究（Dickeyetal.，2015；Lüetal.，2016）。线粒体基因中的3个细胞色素氧化酶亚基编码基因（COI、COII和COIII）进化速率不同，COII基因核苷酸序列及其推导氨基酸序列的进化速率均比其他2个亚基（COI和COIII）高（Petersonetal.，2001）。本研究在Lü等（2016）的研究成果基础上，选用mtDNACOI和mtDNACOII基因作为分子标记，同时增加每个地理种群的测序样本数，分析贵州省茶棍蓟马不同地理种群的遗传变异与进化关系。【拟解决的关键问题】对贵州省11个地理种群茶棍蓟马群体mtDNACOI和mtDNACOII基因的部分序列进行测序，研究贵州省茶棍蓟马群体的遗传多样性及遗传分化情况，探讨群体内在的遗传变异与进化关系，为掌握贵州省茶棍蓟马的遗传动态和扩散规律及制定防控措施提供理论依据。
1材料与方法
1.1
试验材料
以贵州省不同地理种群的茶棍蓟马为供试样本。在野外用小毛笔直接蘸取茶树上的茶棍蓟马，将其放入盛有无水乙醇的样本管中，记录样本采集时间、采集地点及其经纬度等信息，样本带回实验室在显微镜下进行鉴定后置于-20℃保存。具体采样信息见表1。
1.2基因组DNA提取
茶棍蓟马总DNA的提取参照张利娟等（2011）的盐析法，提取单头蓟马DNA，提取的DNA以20μL无菌超纯水充分溶解后-20℃保存备用。
（彭萍等，（·1686·南方农业学报51卷表1贵州省不同地区茶棍蓟马种群采样信息
Table1ThesampleinformationofdifferentgeographicalpopulationsofD.minowaiinGuizhou
地理种群
GeographicalpopulationLSDZPXXYDSSQSNMTCS1CS2GY
采样点
Collectinglocation
雷山县道真县盘县兴义市独山县石阡县思南县湄潭县长顺县长顺县贵阳市
经纬度Latitude，longitude26°22′58″N，108°5′9″E28°38′9″N，107°35′41″E25°24′14″N，104°47′5″E25°7′47″N，104°59′52″E25°34′15″N，107°14′42″E27°36′28″N，108°11′23″E27°46′37″N，108°15′50″E27°43′55″N，107°33′7″E26°9′28″N，106°25′40″E26°1′44″N，106°27′28″E26°30′32″N，106°39′50″E
样本数
Numberofsample
1514161212121414141412
采集时间（年-月-日）Collectingdate（Y-M-D）
2019-05-232019-05-112019-09-052019-07-042019-08-112019-12-262018-07-262018-07-262019-06-052019-06-052019-05-10
1.3
PCR扩增与序列测定
mtDNACOI基因序列扩增使用DNA条形码标准引物LCO1490/HCO2198（Folmeretal.，1994）；参照NCBI数据库中茶棍蓟马线粒体基因组DNA全长序列中的mtDNACOII区域，设计mtDNACOII基因引物DmCOII_F/DmCOII_R（表2）。反应体系50.0μL：TaKaRaPrimeSTARHSDNAPolymerase0.5μL，5×PrimerSTARBuffer10.0μL，dNTPMix-ture4.0μL，上、下游引物各2.0μL，DNA模板3.0μL，无菌双蒸水28.5μL。mtDNACOI扩增程序：94℃预变性5min；94℃1min，53℃1min，72℃80s，进行32个循环；72℃延伸10min，4℃保存。mtDNACOII扩增程序：94℃预变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，进行32个循环；72℃延伸10min，4℃保存。取2.0μLPCR产物进行电泳检测后，对确定含有目的片段的产物进行双向测序（引物合成和测序由北京擎科新业生物技术有限公司完成）。1.4序列分析
利用Chromas2.23对测序所得序列进行峰图质量验证，对序列进行人工读取和反复校验后，将正、反向序列进行拼接得到的完整序列片段在NCBI数据库中进行同源比对，以确定序列是否为所需的目的片段。
1.5遗传学参数计算与分析
利用MEGA6.0分析序列的碱基组成与多态性位点、转换/颠换偏倚率等（Tamuraetal.，2013）；通
表2引物信息
Table2Primerinformation
引物名称PrimerLCO1490HCO2198DmCOII_FDmCOII_R
过DnaSP5.10计算核苷酸多样度（π）、单倍型多样度（Hd）、核苷酸平均差异数（K）及种群间遗传固定指数（FST）、基因流（Nm）等遗传学参数（LibradoandRo-zas，2009）。利用SAMOVA2.0（Dupanloupetal.，2002）对不同地理种群间的分子空间变异进行分析，然后根据SAMOVA分组结果，应用Arlequin3.5.2.2进行中性检验、分子遗传变异方差（AMOVA）和错配分布分析（ExcoffierandLischer，2010）。使用Network5.0绘制基于Median-joining的单倍型中介网络图（Bandeltetal.，1999）。
2结果与分析
2.1
茶棍蓟马mtDNACOI和mtDNACOII基因11个茶棍蓟马种群的mtDNACOI基因经双向拼接和ClustalW序列比对分析后得到137条序列，片段长度665bp，共检测到17个多态性位点，包括11个自裔位点和6个简约信息位点；所有序列的总突变数为17，其中发生转换的位点数为15，发生颠换的位点数为5，转换/颠换率为18.741；所有序列核苷酸A、T、C和G的平均含量分别为31.73%、37.95%、16.64%和13.68%，A+T含量为69.68%，序列碱基组成有明显的A/T偏好性。mtDNACOII基因经双向拼接和比对分析后得到132条序列，片段长度525bp，共检测到16个多态性位点，包括9个自裔位点和7个简约信息位点；所有序列的总突变数为16，其中发生转换的位点数为13，发生颠换的位点数为3，转换/颠换率为序列特征分析结果
引物序列Primersequence
5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'
5'-ATTCTAGTAGTAATTTTACG-3'5'-TAGGTATAAATGGATGTC-3'
扩增片段大小（bp）Amplificationsize
700
540
基于mtDNA CO I和mtDNA CO II分子标记的<p>贵州省茶棍蓟马种群遗传多样性分析</p><p><br/></p>
