实验六 水中细菌总数和大肠菌群的检测
摘 要：本实验以测定公园河流水的细菌总数和大肠菌群的数量，来测定特定地点的水质情况。初步介绍了一种通用的方法来检测水源的健康指标，判定水体的质量。对该实验点的水源作出了定性的评价，以及关于试验中如何提高梯度重复的精度的分析。 关键字：河流水；细菌总数测定；大肠菌群；EMB培养 前言
各种天然水中常含有一定数量的微生物。水中细菌总数往往同水体受有机污染程度呈正相关，因而是评价水质污染程度的重要指标之一。细菌总数是指1mL水样中所含细菌菌落的总数[cfu/g(mL)]，可用稀释平板计数法检测。水中大肠菌群的数量可用来判断水源是否被粪便污染，并可间接推测水源受肠道病原菌污染的可能。
特征：G-无芽孢杆菌，兼性厌氧、在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气。 多管发酵法
初发酵：适当稀释样品，乳糖发酵培养，产酸产气；
分离培养：伊红美蓝（EMB）平板上划线分离，出现紫色、粉红色特征性菌落； 复发酵验证：挑取特征性菌落进行乳酸复发酵验证。
材料和方法
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：用于水中细菌总数测定
牛肉膏5g，蛋白胨10g， NaCl 5.0 g，琼脂8g， 蒸馏水1000ml； pH 7.0 乳糖胆盐蛋白胨培养基：用于初发酵
1×：蛋白胨 20g、牛胆盐 5g、乳糖 10g、0.04%溴甲酚紫水溶液 25mL（调pH值后加）、水 1000mL、pH 7.2－7.4 三倍浓缩液（3×）：除水以外，其余成分取三倍用量
分装：1×的培养基分装9ml/管， 3×的培养基分装5ml/管或50ml/瓶，均装上德汉氏小管。 灭菌条件：115℃ ，15min。
EMB培养基：用于大肠菌群菌落鉴定
脱水培养基，按说明书操作，水用量为90%。 水源：紫竹院河水
仪器： 高压灭菌锅、无菌培养皿、试管、吸管、接种环 、德汉氏小管、温箱、载玻片、酒精灯、显微镜等。
试剂 ： 牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂粉，伊红美兰琼脂培养基、水、乳糖、0.04%溴甲酚紫水溶液、胆盐、革蓝氏染色试剂
具体实验步骤： 1），相关器械的灭菌操作，以及前往紫竹院取少量的样品水。 2），按照上述的配料，无菌操作配置培养基。
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3），细菌总数的测定：取上述样品水，一次稀释10,10,10,3个浓度。对于每个浓度，取1ml稀释液加入冷却好的牛肉膏蛋白胨培养基中，立即混匀，每个浓度重复一次。将平皿倒置培养在37℃的温箱24h，计算平皿的细菌总数。
4），大肠菌群的测定：将样品水稀释成10,10,10,3个梯度。
实验结果与数据分析 1，细菌菌落总数
稀释浓度及菌落数
组别 1 2 平均
10 12 4 8
-1-2-30-1-2
10 0 0 0
10 0 0 0
平板菌落状况 报告方式选取 最低稀释度下菌落数 × 稀释倍数
菌落总数（cfug , cfu/ml
均小于30
8.0×10
2,大肠菌群总数
实验结果 产酸 产气 紫黑色
EMB
粉红色
革兰-G 氏染
色
结论 阳性管数 初发酵
+ + +
原溶液 + + + + + +
+ + +
+ + +
+ + + +
+
+
+ + +
5
+
0
0
- 0
10
-110
-2ck - - - - -
3，EMB 数据值计算 查表可得，MPN=MPN指数?10ml
接种量最大的一管的水样ml接种量最大的管：1ml
每100ml水样中菌数最大可能值：230
95%可信限值 上限：700 下限：70 水样的分析得出这样的结果：细菌总数：80个/mL
大肠菌群数：2300个/L
大肠菌群数占细菌总数：2.88%。
根据我国《生活饮用水卫生标准》GB5749-85规定 细菌总数不超过100个，已达标。
大肠菌群不得超过1000个，超标。
经过严格的消毒处理，大肠杆菌不超过10000个，水样达标。
结论：从上述的水样分析，我们可以得出此处的河流水污染不是很严重，作为景观水，已经达到了标准，但是此类水是不能作为饮用水的，可能存在一些粪便的污染，导致大肠菌群的数量过高，倘若经过严格的消毒灭菌，才能饮用。
实验讨论：
1， 大肠菌群的定义是什么？、为什么要选择大肠菌群作为水源被肠道病原菌污染的指示菌？
大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。而由于大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。大量的调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，而且人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。所以大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。
2，EMB培养基含有哪几种主要成分？在检查大肠菌群时，各起什么作用？
EMB培养基主要包含以下几种物质：蛋白胨，乳糖，蔗糖，磷酸二氢钾，伊红Y，美蓝，蒸馏水。EMB培养基的机制就是靠微生物在发酵过程中，使培养基发生分解，产生大量的氢离子，从而改变培养基的PH，由于提前添加的指示剂，在PH值的改变下，就会发生颜色的变化，从而鉴定生长的菌种。在检测大肠菌群的时候，蛋白胨提供了氮源，磷酸二氢钾提供了磷元素和钾元素，
实验应注意的问题以及改进： 1，样品的问题
由于本实验是一个检测的实验，存在一个严格灭菌的过程。从采样，到最后的分析，整个过程不仅不能让其他杂菌污染，而且还得保证样品中本身细菌的总数基本不损失。 1），采样的器械必须是经过严格灭菌的，而且其本身的构造不会对微生物的生存造成威胁。 2），由于样品会处于密闭的过程，水中的含氧量会慢慢降低，所以对样品的处理应该尽快处理。 3），对于样品的稀释不应该用蒸馏水，而应该用灭菌的生理盐水，防止细菌吸水裂解死亡。 4），整个接种的操作必须正确，不能杀死细菌，或者引入其他杂菌。 2，关于梯度重复的问题
本实验设计到一个很关键的问题，那就是梯度重复。对于一个梯度的实验量的统计和处理，我们常常采用重复，来解决其实验误差所造成的影响，但有些时候重复增加了大量的工作量，却没有根本提高实验的准确性，仅以本实验为例。在对细菌数量测定时候，我们每
个梯度设置了2个重复，在事实上，第一个梯度的准确性很高，但是在最后一个梯度，可能存在很大的误差。在对一个样品进行定量分析的时候，我们往往要考虑很多干扰它的因数。假定我们所取的样品现在要进行一个梯度的稀释后取样，当前浓度为c，取样的体积为v，那么假定单位体积内只存在一个细菌，则可以建立如下的数学模型：
w??xni?xnxaix?cv,xi?x?aip,ai?p?kcvcv?cv?
?k?a??i???vc?n?从模型中，我们可以得到最终的表达式：w?,ai?nvcai??vc??，当取样体
积和梯度恒定的时候，我们不难发现，增大取样的重复数，可以提高实验的精确度，但是当c足够大的时候，分子本身就会变得无限小，而分母的一次增量远不如多次的。同理，当c很小的时候，分子变得很大，分母变得很小，这个时候不增加次数，或者调解取样体积，会造成很高的实验误差，所以，本实验的三个精度变量就是梯度，取样体积，梯度重复数。鉴于对本实验的最后分析，我们觉得，在后两个梯度有必要增加重复数，虽然增加了工作量，但是可以有效避免较大的实验误差带来的干扰。同样，在对其他的实验样品处理过程中，原始浓度一般只需要2个重复，随着数量级的增加，其重复的次数也应该发生变化，不应该不
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变，诸如在在10，设置4个重复，而10时候，可以设置8个重复，这样可以在追求最简工作量的时候，获得最简的实验结果。
参考文献：
[1] 王玉兰. 环境微生物学实验方法与技术.北京，化学工业出版社. 2009,3. [2] 陈坚. 环境微生物实验技术. 北京：化学工业出版社，2008
[3] 钱存柔. 微生物学实验教程（第二版）.北京：北京大学出版社，2008 [4] 周德庆. 微生物学教程（第二版）. 北京：高等教育出版社，2002,5. [5] 沈萍. 微生物学. 北京：高等教育出版社，2000.
[6] 徐全智，杨晋浩. 数学建模（第二版）. 北京：高等教育出版社，2008.
微生物实验报告：水中细菌总数和大肠菌群的检测
