(四)基因转移方法(五)转导细胞的选择鉴定(六)回输体内
2.请你评价一下人类基因组计划（HGMP）完成的意义 (1)对人类疾病基因研究的贡献
人类疾病相关的基因是人类基因组中结构和功能完整性至关重要的信息。对于单基因病，采用“定位克隆”和“定位候选克隆”的全新思路，导致了亨廷顿氏舞蹈症、遗传性结肠癌和乳腺癌等一大批单基因遗传病致病基因的发现，为这些疾病的基因诊断和基因治疗奠定了基础。对于心血管疾病、肿瘤、糖尿病、神经精神类疾病（老年性痴呆、精神分裂症）、自身免疫性疾病等多基因疾病是目前疾病基因研究的重点。健康相关研究是HGP的重要组成部分，1997年相继提出：“肿瘤基因组解剖计划”“环境基因组学计划”。
(2)对医学的贡献:基因诊断、基因治疗和基于基因组知识的治疗、基于基因组信息的疾病预防、疾病易感基因的识别、风险人群生活方式、环境因子的干预 对生物技术的贡献 胚胎细胞克隆羊——多利 ⑴基因工程药物
分泌蛋白（多肽激素，生长因子，趋化因子，凝血和抗凝血因子等）及其受体。 ⑵诊断和研究试剂产业
基因和抗体试剂盒、诊断和研究用生物芯片、疾病和筛药模型。 对细胞、胚胎、组织工程的推动
胚胎和成年期干细胞、克隆技术、器官再造。 (3)对制药工业的贡献
筛选药物的靶点：与组合化学和天然化合物分离技术结合，建立高通量的受体、酶结合试验以知识为基础的药物设计：基因蛋白产物的高级结构分析、预测、模拟—药物作用“口袋”。 个体化的药物治疗：药物基因组学。
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(4)对社会经济的重要影响
生物产业与信息产业是一个国家的两大经济支柱；发现新功能基因的社会和经济效益；转基因食品；转基因药物（如减肥药，增高药） (5)对生物进化研究的影响
生物的进化史，都刻写在各基因组的“天书”上；草履虫是人的亲戚——13亿年；人是由300～400万年前的一种猴子进化来的；人类第一次“走出非洲”——200万年的古猿；人类的“夏娃”来自于非洲，距今20万年——第二次“走出非洲”？ (6)带来的负面作用
侏罗纪公园不只是科幻故事；种族选择性灭绝性生物武器；基因专利战；基因资源的掠夺战；基因与个人隐私。
3.分子生物学实验中所涉及的引物有哪几种，各有什么用途和特点？ 1）纯粹的用于扩增目的基因片段的引物，这种引物一般都是成对出现。
2）用于基因测序用的引物，一般如果所测的片段长度短的话（小于800bp），可以用一条，当然两条正反通测也可以。
3）用于筛选的引物，比如平时常见的SSP，RFLP等引物，这种引物也是成对出现的，但主要用于基因多态性筛选的，针对单位点多态性来说。 4.简述3～4种PCR衍生技术及其应用
(1) Anchored PCR:用酶法在一通用引物反转录cDNA 3’末端加上一段已知序列，然后以此序列为引物结合位点，对该cDNA进行扩增。应用：扩增未知或全知序列，如未知cDNA的制备，低丰度cDNA文库的构建。
(2) 不对称PCR：两种引物浓度比例相差较大的PCR技术。在扩增循环中引入不同的引物浓度，常用50-100：1的比例。最初10-15个循环主要产物是dsDNA，但是，低浓度引物被耗尽之后，高浓度引物介导的PCR反应会产生大量单链DNA。应用：制备ssDNA片
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段，用于序列分析或者核酸杂交的探针。
(3) RT-PCR 当扩增模板为RNA时，需要先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能扩增。RT-PCR应用非常广泛，无论是分子生物学还是临床检验都经常用。
(4) 修饰引物PCR 为达到某些特殊的应用目的，如定向克隆，定点突变，体外转录及序列分析等，可在引物5’端加上酶切位点，突变序列，转录启动子，序列分析结合位点等。 ASO-PCR, SSCP-PCR,real-time PCR, Taqman-PCR,
同济医科大学2003年分子生物学（博士）811
一名词解释并写出对应的英文名词（共10小题，每小题5分，共50分） 1.克隆载体 2.表达载体 3.断裂基因 4.双脱氧核苷酸（简单）5.多克隆位点 6.启动子 7.癌基因 8.核糖体结合位点（简单） 9.增强子 10.开放阅读框架
1.克隆载体：为“携带”感兴趣的外源DNA、实现外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。一般为质粒或者噬菌体。
2.表达载体：为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻译成多肽链而设计的克隆载体 3. 断裂基因：真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因。
4. 双脱氧核苷酸: 3′-双脱氧核糖通过β糖苷键连接而成的化合物，主要用于Sanger法测序。双脱氧核苷酸终止子是指在脱氧核苷酸的3号碳上面连接的一个可逆阻断的荧光基团，使之无法直接与下一个脱氧核苷酸生成磷酸二酯键，DNA链暂时被终止。
8. 核糖体结合位点是mRNA上的特异性序列，核糖体可以识别并结合这一序列来启动翻译过程。在原核生物中该序列称为SD序列，在真核生物中则称为Kozak序列
10.开放阅读框[open reading frame，ORF] 是结构基因的正常核苷酸序列，从起始密码子到终止密码子的阅读框可编码完整的多肽链，其间不存在使翻译中断的终止密码子 二问答题（共3小题，每小题10分，共30分） 1.什么是分子克隆技术？它的主要步骤是什么？
在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。
2.真核细胞和原核细胞基因表达在转录水平上调控的特点。
原核细胞： 1.转录起始调控：(1) ｏ因子与启动子的作用模式 原核细胞的RNA-pol只有
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一种，组成成分为α2’σ σ因子与启动子结合。在原核生物分化发育过程中，不同基
因有序表达也是不同σ因子在不同时间产生并发挥作用引起的。(2) 转录起始的负调控 最典型的是乳糖操纵子的调节(3) 转录起始的正调控 典型例子是阿拉伯糖操纵子，ara C基因产物Ara C起着关键作用，当环境中有阿拉伯糖时，Ara C形成dimer与I1、I2结合，激活BAD基因转录。(4) 转录起始的复合调控 葡萄糖代谢产物的分解阻遏负调控和CAP-cAMP复合物的正调控。2. 转录终止调控：(1) 依赖于ρ因子的转录终止，色氨酸操纵子中有衰减子(2) 不依赖于ρ因子的转录终止，识别发夹结构，使转录停止。
真核细胞：1.转录前调控：(1)染色体结构对转录的影响： 疏松的染色质转录活跃(2)DNA的修饰：真核基因CpG island中的C通常被甲基化，阻碍某些基因转录。2. 顺式作用元件：真核基因非编码区中调控基因转录的DNA序列，包括启动子、增强子、沉默子。3.反式作用因子：一类细胞核内的蛋白质因子，可以与RNA-pol和顺式作用元件相互作用，调节基因转录。(1)基本转录因子：在真核基因启动子上，参与组装转录起始复合物的蛋白质因子。TFII有6种。(2)特异性转录因子：结合在核心转录原件以外的其它上游顺式作用元件的蛋白质因子，通过DNA-蛋白质相互作用，调节基因转录，可以对环境变化迅速作出反应。与GGGCGG box结合的激活蛋白称为SP1;与CCAAT box结合的转录因子称为CBF。SP1和CBF都能够与特异性的DNA序列结合，启动转录。多种类固醇激素也是特异转录因子，与相应受体结合后，作用于激素应答序列，促进转录。此外，在真核基因中也存在转录抑制因子，可以覆盖转录活化区，或者覆盖转录起始点，与基础转录因子相互作用，抑制转录。2. 反式作用因子与DNA相互作用的模式：helix-turn-helix, Zenic finger, leucine zipper, helix-loop-helix.
3. 就你所知RNA研究领域中，理论和技术方面的进展有哪些。
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RNA具有生物功能多样性，在遗传信息的翻译中起决定作用，mRNA有信使和模板的作用，转运RNA可以转运氨基酸和信息交换，rRNA有装配和催化作用。1992年Holler等证明转肽反应有核糖体大亚基催化。核酶的发现——RNA具有催化功能和持家功能。 RNA编辑：RNA编码序列的改变称为RNA编辑。hnRNA snRNA戴帽加尾防止降解。 反义RNA：与mRNA序列互补的一段RNA，可以沉默mRNA的翻译。
(1). RNA剪切是真核生物基因表达过程中一个非常重要的机制，经过RNA的剪切、连接以后即可产生具有编码信息功能的mRNA。RNA剪切机制在生物的生长发育过程中至关重要。RNA剪切就是将基因组中转录出来的RNA前体中的内含子剪切出去，然后再在相应酶的作用下将剪切后的RNA重新连接起来. RNA的剪切位置主要依赖于剪切位点的判定，剪切位点一般都具有其专属特定的序列。麻省理工学院的研究人员开发出一种新的计算方法来预测遗传材料中的哪些序列转录为RNA时会象电影剪接室中被剪掉的胶片一样被剪切掉，哪些会最终幸运地成为生命的蓝图。 (2) RNA测序分析中的最新进展
使用一种叫做RNA-seq的技术，最新的高通量DNA测序技术现在能够被大规模地应用于捕获一个细胞中整套的mRNA转录本。尽管RNA-seq才仅仅两岁，但是它已经迅速蔓延到基因组学领域，并且它现在正在被用于分析从细菌到灵长类生物的转录组。测序的深度允许研究者定量基因表达水平，以在真核生物物种中发现选择性异构体，甚至描述细菌基因组的操纵子结构
(3) RNA干扰技术研究新进展
RNA干扰( RNA interfer ence, RNAi)是由双链 RNA 介导的序列特异的基因沉默现象, 它在转录水平、 转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达,具有高效性和高特异性的特点。小干扰 RNA ( small interfer ing RNA 或 shor t inter fering RNA, siRNA) 是 RNAi作用
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同济考博-分子生物学真题-答案
