Advances in Microbiology 微生物前沿, 2020, 9(3), 114-124
Published Online September 2020 in Hans. http://www.hanspub.org/journal/amb https://doi.org/10.12677/amb.2020.93017
多粘类芽孢杆菌绿色制备纳米银及其 抑菌活性
范月圆，唐 晨，季 逸，马骥昌，褚衍亮*
江苏科技大学，生物技术学院，江苏 镇江
收稿日期：2020年8月19日；录用日期：2020年9月9日；发布日期：2020年9月16日
摘 要
本文利用一株桑叶内生菌——多粘类芽孢杆菌381的无细胞发酵液进行纳米银的胞外合成。微生物合成的纳米银溶液呈现红棕色，紫外全波长扫描结果显示在418 nm处有典型吸收峰。对纳米银合成的条件进行优选，结果表明，以内生菌株的LB培养液为还原剂和稳定剂，在与0.01 M硝酸银溶液以1:1体积比条件下37℃避光反应72 h，可以获得分散性良好的纳米银颗粒溶液。偏碱性条件有利于菌株发酵液还原制备纳米银，以pH 9时效果最好。平板打孔法实验表明，纳米银溶液随剂量增加，对桑青枯菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用均可增强，但对桑疫病菌的抑制效果不明显。液体培养法表明，合成的纳米银溶液对两株病原菌的最小抑菌浓度分别为50和30 ug/mL。
关键词
内生菌，多粘类芽孢杆菌，纳米银，生物合成，抑菌作用
Green Preparation of Silver Nanoparticles by Paenibacillus polymyxa 381 and its Antibacterial Activity
Yueyuan Fan, Chen Tang, Yi Ji, Jichang Ma, Yanliang Chu*
College of Biotechnology, Jiangsu University of Science and Technology, Zhenjiang Jiangsu
ththth
Received: Aug. 19, 2020; accepted: Sep. 9, 2020; published: Sep. 16, 2020
*通讯作者。
文章引用: 范月圆, 唐晨, 季逸, 马骥昌, 褚衍亮. 多粘类芽孢杆菌绿色制备纳米银及其抑菌活性[J]. 微生物前沿, 2020, 9(3): 114-124. DOI: 10.12677/amb.2020.93017
范月圆 等
Abstract
In this paper, the extracellular synthesis of silver nanoparticles was carried out in a cell-free fer-mentation broth of an endophyte of mulberry leaves, Paenibacillus polymyxa 381. The silver na-noparticles solution synthesized by microorganism showed a reddish brown color, and the ultra-violet full-wavelength scanning results showed a typical absorption peak at 418 nm. The condi-tions for the synthesis of silver nanoparticles were optimized, and the results showed that using the LB culture broth of the inoculant strain as reduced agent and stabilizer, the silver nanopar-ticles with good dispersion could be obtained by reacting with silver nitrate solution at a 1:1 vo-lume ratio at 37?C for 72 h. The alkaline condition was favorable for the preparation of silver na-noparticles with the fermentation broth, with the best effect at pH9. The experimental results showed that the inhibition effect of nano silver solution on Ralstonia solanacearum and Staphylo-coccus aureus could be enhanced with the increase of the dose, but the inhibition effect on Pseu-domonas syringae pv. mori was not obvious. The liquid culture method showed that the minimum inhibitory concentration of the synthesized silver nanoparticles to the two pathogens was 50 and 30 ug/mL respectively.
Keywords
Endophytic Bacteria, Paenibacillus polymyxa 381, Silver Nanoparticles, Biosynthesis, Bacteriostasis
Copyright ? 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc.
This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0). http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
Open Access 1. 引言
细菌耐药性是疾病预防与治疗中面临的重大问题之一。经典抗生素作用范围和效果的持续缩小与减弱促使科学家不断探究新的抗菌药物，因此以纳米银为代表的无机抗菌制剂又一次引起学者们的广泛关注[1] [2] [3]。纳米颗粒(silver nanoparticles, AgNPs)是指单维尺度在1~100 nm范围内的颗粒[4] [5]，具有很高的表面积与体积比，有良好的小尺寸效应与隧道效应[6] [7]，被广泛应用于生物抗菌领域[8] [9]、生物传感器[10]、环保材料制备及水污染物处理[7] [11] [12]等领域，是当前纳米技术的重要发展方向之一。纳米颗粒的制备有物理、化学及生物还原法，前两种方法需要高温、高压条件或使用有毒性的还原剂、稳定剂，具有生产能耗高及毒性试剂残留等缺点，生产的纳米颗粒易产生团聚导致分散性不好[13] [14]。采用生物方法，尤其是微生物进行金属离子的还原而制备纳米金属颗粒，其合成过程以生物体自身的代谢产物为还原剂，在常温下即可完成，合成的纳米颗粒可与某些生物分子结合从而具有良好的稳定性和分散性，因此逐渐受到学者们的重视[11] [12] [13] [14]。研究发现，采用生物学方法制备的纳米银颗粒具有良好的分散均一性，具有抗菌、抗肿瘤及抗氧化等多种生物活性，其对病原菌的抑制效果优于银块状金属，且不易产生抗药性，并且可增幅抗生素的活性作用，在医药领域具有广泛的应用前景[13] [14] [15] [16]。细菌是最早被用于纳米银合成的微生物[15]。细菌广泛分布于不同环境，种类多，生长速度快，人工培养条件简单可控，已经成为纳米银合成的重要菌株来源，目前已报道利用土壤、水体及植物内生菌中的大肠杆菌[17]、希瓦氏菌[7]、北极副球菌[18]及乳酪短杆菌、假单胞杆菌等菌株成功合成纳米银[11]-[16]。并对纳米银的安全性进行了比较分析[19]。
DOI: 10.12677/amb.2020.93017
115
微生物前沿
范月圆 等
类芽孢杆菌广泛分布于自然界多种环境中，是植物微生态的优势种群之一。类芽孢杆菌在生长过程中可产生脂肽、多烯等抗生素物质，还具有很强的蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶等活性，在医疗、植物病原菌防治及环境等方面具有很大的应用价值[20] [21] [22]。本实验室从健康桑叶中分离得到一株内生类芽孢杆菌，经生理生化及分子生物学方法鉴定为多粘类芽孢杆菌，其对桑叶病原菌青枯菌和疫病病原菌M4-13均有一定的抑制作用，植化分析表明其中含有生物碱、黄酮及萜类产物[23]。初期的筛选结果表明菌株381可以进行纳米银的绿色合成。本文对纳米银生物制备的条件进行研究，并进一步检验合成纳米银的抑菌活性，一方面可丰富内生细菌的生物功能及作用，另一方面也为纳米银的生物合成研究提供参考数据。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
2.1.1. 实验菌株
桑叶内生细菌381由本实验室分离并保存，经分子生物学方法鉴定为多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa 381 [23]。病原细菌：桑青枯菌Ralstonia solanacearum、桑疫病病原菌Pseudomonas syringae pv. Mori M4-13和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus均为本实验室保存菌株。 2.1.2. 实验仪器与试剂
主要实验仪器：UV9600紫外可见分光光度计(北京瑞丽)，(ALLEGRA 64R)高速冷冻离心机(美国贝克曼)，DHZ-052D型双层恒温摇床(常州朗越仪器制造有限公司)，CXZ智能型光照培养箱(宁波江南仪器厂)，UV-2450紫外可见分光光度计(日本岛津)，SW-CJ-1F单人双面净化工作台(上海苏达实验仪器有限公司)。
主要试剂：葡萄糖、硝酸银、氢氧化钠、硝酸等为分析纯试剂，琼脂粉、酵母浸膏、胰蛋白胨等为CP级。以上试剂购自国药化学试剂公司。
2.2. 实验方法
2.2.1. 内生细菌的发酵和无菌滤液制备
将多粘类芽孢杆菌381菌株划线接种到马铃薯葡萄糖琼脂固体(PDA)培养基中，35℃培养24 h，无菌取0.5 mL菌液接种到无菌的LB液体培养基(不含氯化钠)中，150 rpm，水冲洗菌苔，调整菌液OD600为1.0，37℃，震荡培养3 d。
无菌体发酵液的制备：取培养3 d的细菌发酵液，在8000 rpm，4℃条件下离心20 min，收集上清液即为无细胞发酵液，保存于4℃冰箱中备用。 2.2.2. 纳米银的生物合成
配置0.01 M的硝酸银水溶液，按一定体积比与制备的无细胞发酵液混合，置于摇床中，在150 rpm，37℃避光条件下震荡反应进行纳米银的生物合成。 2.2.3. 生物合成纳米银的检测
颜色变化：混合溶液反应后，间隔不同时间观测反应溶液的颜色变化，分别以纯无细胞发酵液和硝酸银溶液为对照。
紫外全波长波谱扫描：间隔不同时间取0.5 mL上述混合溶液，加2.0 mL去离子水稀释5倍，用紫外可见光分光光度计在300~800 nm范围内进行波谱扫描，波长间隔1 nm。
DOI: 10.12677/amb.2020.93017
116
微生物前沿
范月圆 等
2.2.4. 生物合成纳米银的条件选择
菌液与硝酸银溶液的体积比 将内生细菌的无细胞上清液，分别与10 mM AgNO3溶液按照1:9、3:7、1:1、7:3和9:1的体积比混合，按照2.2.2中的方法进行纳米银颗粒的合成。反应开始后，每间隔1 h取样进行波谱扫描，取样6次后间隔12 h再取样测定，连续检测72 h，观察反应溶液的特征吸收峰变化。
AgNO3溶液的浓度 分别配制2，4，6，8和10 mM的AgNO3溶液，以优选体积比例与无细胞发酵液混合进行纳米银颗粒的合成，反应起始后每间隔12 h进行一次吸收光谱扫描，选择合成纳米银所需的硝酸银浓度。
无细胞发酵液的pH值 分别采用2 M的硝酸溶液和氢氧化钠溶液将内生菌株的无细胞上清液的pH值分别调至5，6，7，8，9，再与适当浓度的AgNO3溶液按适合比例混合，从反应起始至结束，每间隔12 h进行一次全波长吸收峰扫描，以确定纳米银生成的适当pH。
2.3. 生物合成纳米银的抑菌活性
平板打孔抑制试验：将青枯菌、桑疫病菌M4-13和金黄色葡萄球菌分别划线接种到PDA平板上，35℃活化培养24 h。以无菌水冲洗培养平板上的菌苔，调整菌液OD600 = 0.6，取0.1 mL菌液，均匀涂布到新的LB (金黄色葡萄球菌和青枯菌)和PDA平板(M4-13)。用直径5.96 mm的打孔器于涂菌平板上均匀打出6个孔，分别吸取10 mM AgNO3溶液20 μL、内生菌无细胞发酵液20 μL，合成的纳米银液20、40、60 μL，以1 mg/mL的氨苄青霉素溶液为阳性对照，在35℃下恒温培养24 h后，测量各孔周围的抑菌圈大小，重复3次，计算抑菌圈的平均值。
最小抑菌浓度测定：离心分离合成的纳米银溶液，低温烘干后得到纳米银粉末，以无菌去离子水分别配置10~100 μg/mL的纳米银溶液，分别接0.5 mL到装有5 mL病原菌LB培养液的试管中，37℃ 150 rpm培养24 h后，观察菌液的浑浊度和生长情况，澄清且无菌生长的试管所对应的最小纳米银添加浓度作为最小抑菌浓度。实验重复3次。
实验结果以Excel进行绘图，数据分析采用SPSS 22.0软件进行。
3. 结果
3.1. 纳米银的生物合成检测
多粘类芽孢杆菌菌株381发酵后制备的无细胞发酵液与10 mM的AgNO3溶液避光反应72 h后，可见混合溶液由初始的浅黄色变为红棕色，全波长光谱扫描结果显示反应后溶液在418 nm有明显的吸收峰，纯硝酸银溶液和无细胞发酵液扫描结果均没有此特征吸收峰(图1(a)和图1(b))。银离子被还原成单质纳米银后，在不同光波频率激发下，纳米银结构可产生专一性的表面等离子体共振效应(surface plasmon re-sonance, SPR)，并对特定频率光波(400~460 nm)有显著吸收，这是纳米银颗粒的典型特征，其峰值与颗粒的密度成正相关，这已经在微生物及植物提取物合成纳米银的实验中被证实[6] [8] [9] [15] [24] [25] [26]。因此本实验结果表明菌株381可在细胞外进行纳米银颗粒的生物合成。
3.2. 纳米银颗粒生物合成的条件选择
3.2.1. 反应时间对纳米银颗粒合成的影响
10 mM AgNO3溶液与381菌株的无细胞发酵液按1:1 (v:v)的比例混合后，初期(0~6 h内)溶液并无明显的颜色变化，12 h后反应溶液在450 nm附近开始出现微弱的吸收峰，24 h后扫描吸收峰逐渐偏向短波长(见图2(a))，溶液颜色逐渐加深，但底部无沉淀物生成。72 h后溶液吸收峰稳定在418 nm，表明有纳米银颗粒的持续生成。反应期间典型吸收峰的光吸收值随反应时间延长持续增大(见图2(b))，表明菌液的
DOI: 10.12677/amb.2020.93017
117
微生物前沿
范月圆 等
还原力可在较长时间内保持活性，其中的代谢产物可使纳米颗粒趋向稳定，并能保持良好的分散性，溶液颜色均一。因此选择72 h作为菌株381胞外合成纳米银的反应时间。
(a) (b)
Figure 1. UV-Vis spectrum and color change of silver nanoparticles synthesized by Paenibacillus polymyxa 381 图1. 多粘类芽孢杆菌381合成纳米银溶液的吸收光谱及颜色变化
(a) (b)
Figure 2. Effects of reaction time on the synthesis of silver nanoparticles. (a) UV-Vis spectrum of AgNPs at different reac-tion time; (b) absorbance value at 418 nm
图2. 反应时间对纳米银生成的影响。(a) 不同反应时间的吸收光谱；(b) 418 nm的光吸收值变化
3.2.2. 混合体积比对纳米银合成的影响
将381菌株的无细胞发酵液分别与10 mM AgNO3溶液按不同的比例混合，反应72 h，对反应溶液的全波长扫描结果见图3(a)。菌液增多，硝酸银含量过少，纳米银的生产量少，无明显吸收峰。硝酸银过多，菌液的还原力不足，纳米银的生成量也少，典型吸收峰降低(见图3(b))。当菌液和硝酸银比例在1:1时，纳米银的合成效率最好，反应72 h后吸收值达到最大，明显好于其他比例条件，因此选择1:1作为后续实验配比。
3.2.3. 硝酸银浓度对纳米银颗粒合成的影响
381菌株的无细胞发酵液分别与2~10 mM的硝酸银溶液按1:1比例混合，反应72 h后，反应溶液的吸收光谱结果见图4。硝酸银作为银离子供体，在浓度较低(2~4 mM)时，溶液基本没有吸收峰，当银离
DOI: 10.12677/amb.2020.93017
118
微生物前沿
多粘类芽孢杆菌绿色制备纳米银及其抑菌活性 - 图文
