国内外研究现状和发展趋势： （1）光合作用与光呼吸
植物光合作用与人类的生产生活息息相关，绿色植物通过光合作用进行CO2的固定，合成有机物质，是一切生命生存发展的基础。而植物光呼吸作用是绿色植物利用光能，吸收O2，放出CO2，表现为光合作用的表观逆转。C3植物通过光呼吸所损失的碳占净光合速率的25%以上，且在全球不断升温的气候环境下，这一比例正呈上升趋势（Cegelski et al,2006）。合理控制光呼吸、提高净光合速率从而提高作物产量一直以来都是植物生物学家和育种学家所致力的一个目标（Peterhansel et al,2011）。
（2）光呼吸关键酶乙醇酸氧化酶及其调控
乙醇酸氧化酶（Glycolate oxidase,简称GLO）是光呼吸代谢的关键酶（Richardson and Tolbert,1961;Moran et al.,1994;Eaquivel et al.,1998），它催化乙醇酸氧化生成乙醛酸，还可进一步催化乙醛酸氧化生成草酸，两步催化反应都伴随有H2O2的产生（Richardson and Tolbert,1961）。自从光呼吸途径被提出以来，人们围绕如何抑制GLO活性从而降低光呼吸作用进行了大量的研究。Zelitch等（2009）报道在C4植物玉米（Zea mays）中筛选到GLO突变体，其活性与野生型相比大概下调95%，研究发现其在正常大气条件下不能存活，而当转移到高CO2条件下培养时能恢复其表型，即出现所谓的光呼吸表型。胥华伟等（2009）利用反义RNA技术来调控水稻GLO活性，也出现了同样的表型，他们的研究结果显示：GLO表达下调后，水稻的光合速率并没有升高反而是下降，且随着酶活性的降低而呈进一步下降，但其具体的调控机理还有待深入研究。陆育生等（2013）报道在水稻中存在未知的氧化乙醇酸形成乙醛酸的途径，研究发现在GLO活性下调的干涉植株中，乙醇酸的氧化产物乙醛酸不仅没有减少，反而大量积累。正是不断积累的乙醛酸抑制了Rubisco的活性，从而导致了光合速率的下降，使得植物表现出光呼吸表型。以上结果表明：通过抑制GLO活性来降低光呼吸、提高光合作用从而提高作物产量是行不通的，GLO在植物中扮演着至关重要的角色。
此外，光呼吸途径中通过GLO反应产生的H2O2可达总量的70%以上，可见其作用是不可小觑的（Corpas et al.,2001;Nocter et al.,2002）。而H2O2作为一种信号物质，在植物信号转导、抗非生物胁迫与生物胁迫等方面具有重要作用（Neill et al.,2002）。
（3）对乙醇酸氧化酶互作蛋白的研究
一直以来，通过生物信息学分析，都认为水稻中存在6条有可能编码乙醇酸氧化酶的基因，并根据其在染色体上的位置命名为OsGLO1-OsGLO6。直到2012年，张智胜等人通过酵母异源表达的方法最终确定水稻中乙醇酸氧化酶是由GLO1与GLO4两个基因共同编码调控的。
类似这种编码调控方式的还有西红柿的果糖激酶等。Odanaka等（2002）发现西红柿当中的果糖激酶是由Frk1,Frk2两个基因共同编码调控，并且这两个基因分别编码的不同的同工酶具有不同的生物学功能。而水稻当中的GLO1与GLO4是否也有同样的特点，还有待深入研究。
Ralf等（1993）在研究叶片过氧化物酶体中的蛋白结构，发现了涉及光呼吸代谢的多酶复合体。乙醇酸氧化酶作为光呼吸代谢的一种关键酶很有可能就位于这样的多酶复合体中，但迄今未见后续相关的研究报道，更未见水稻乙醇酸氧化酶互作蛋白的报道。
(4) 蛋白互作的研究方法
目前, 人们对蛋白质相互作用的研究正经历着3个递进阶段: (i)鉴定与目的蛋白质有相互作用的所有可能蛋白质；(ii) 在互作蛋白已被鉴定出来的前提下，在尽可能接近自然条件下确定目的蛋白与互作蛋白间的相互作用及其对功能的影响；(iii) 鉴定出调节目的蛋白与互作蛋白相互作用的关键因子以准确解释蛋白质相互作用。
对于蛋白互作的研究具有多种方法。串联亲和纯化（tandem affinity purification, TAP）耦联质谱技术是近年出现的一种新的研究蛋白质相互作用的方法，它特别适用于研究生理条件下蛋白质的相互作用，能揭示细胞内部蛋白质分子之间的相互作用网络，是研究蛋白质相互作用的方法学上的突破。
串联亲和纯化技术（TAP）最早是于1999年被Rigaut等提出，并在酵母中成功运用。该方法是在目的蛋白的一端融合表达一段金黄色葡萄球菌蛋白A（Protein A）的IgG结合区和钙调蛋白的结合肽（CBP），并在中间加入一个TEV蛋白酶的酶切位点（Rigaut，et al.1999）。在纯化过程中，蛋白的粗提物在非变性条件下通过ProA 与IgG亲和柱特异结合除去杂蛋白，然后用TEV蛋白酶切割标签ProA,释放仍挂有CBP 的蛋白复合物；在钙离子存在的情况下，将上面的纯化产物与钙调蛋白亲和柱一起孵育, 通过CBP亲和标签复合物再次被纯化，最后在温和的条件下利用EGTA洗脱除去杂蛋白和TEV 蛋白酶剩余物。通过这样的两步连续纯化就可得到高纯度的天然构象的蛋白。
（5）TAP技术的改进
最早开发的ProtA-TEV-CBP标签不可能适用于所有蛋白的纯化，自TAP系统被提出以来，人们根据不同的需求对它进行了多方改进。例如Rohila等（2004）首次利用TAP技术分离植物瞬时表达系统当中的蛋白，去除了CBP的核定位序列；Rubio等（2005）首次利用TAP技术来分离植物稳定表达系统当中的蛋白，将TEV酶切位点换成低温活性的人鼻病毒3C蛋白酶切位点，使得标签能在4oC时得到有效切割；并用6xHis 和9xMyc 替代了CBP 模体, 避免使用EGTA，稳定了复合体结构和活性。
研究目的与意义：
在本研究中，我们也对最先的TAP系统进行了适当的改进，并制定了两种方案。 在第一种方案中，以免疫沉淀法代替原始TAP技术的第一步纯化过程，从而避免了TEV蛋白酶的污染以及TEV蛋白酶对靶蛋白结构的影响，并在一定程度上节约了实验成本。然后将免疫共沉淀法获得的蛋白复合物溶解后，通过亲和层析法进行第二步纯化。
在第二种方案中，我们选用了strepII和6*his标签作为串联亲和纯化的标签。相比21KD的ProtA-TEV-CBP标签，该标签仅只有2KD，不会对目的蛋白的结构与功能造成影响。且两步纯化过程的洗脱条件都相当温和。
我们拟采用以上两种方案并结合质谱技术，分离分辨GLO1与GLO4的互作蛋白，并研究其对GLO活性的调控机理；旨在最终深入了解互作蛋白调控GLO的生物学意义。了解GLO的分子调控机理，对阐明植物光呼吸与光合作用的调控机理具有十分重要的作用。
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