时分子信标应用于聚合酶链反应(PCR)的检测，由于分子信标的灵敏性，可以对扩增产物和整个扩增过程进行实时监测。近年来，随着分子信标技术的不断发展，人们通过改变分子信标的结构，构建了许多新型的分子信标来检测DNA。在分子信标结构的茎部设计一个空缺位点且空缺位点的对面是C碱基，荧光小分子ATMND能通过氢键结合到空缺位点处的未配对C碱基，从而形成非标记分子信标，使其荧光发生淬灭。当加入与分子信标环状部分互补的目标DNA后，分子信标的发卡结构打开释放出ATMND使其荧光恢复，从而实现对目标DNA链的检测。本研究的意义在于设计的非标记分子信标不需要通过共价的方式对DNA探针进行标记，因而具有结构简单，容易合成且价格低廉的特点。此外，我们研究的非标记分子信标的两端是未占据的，因而可以进行其他修饰（图1）。
S1AMNDTarget DNAcytosinegap site
图1 实验原理图
2 实验部分
2.1 主要试剂及仪器
2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶(ATMND)、二甲基砷酸钠、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）。实验中所用试剂均为分析纯，实验用水均为高纯水。DNA由上海生工生物工程技术公司生产合成，序列如表1所示。
RF-5301荧光分光光度计(日本岛津）、PC紫外-可见分光光度计（日本岛津）。 2.2 荧光光谱的测量
用带有热电温度控制盒的荧光分光光度计在370到500nm波长范围内测量，荧光激发波长350nm。激发和发射狭缝宽度为0.5nm到2.0nm之间，扫描速度为100nm/min。
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表1 探针和目的寡核苷酸设计
名称 M1
序列
3-CCTGCCACGCTCCGCCCCTAGCTCTAAATCACTA
TGGTCGCGCTAGG-5
S1 cDNA TM TM2 TM4 TN
、
、
注释
3- GCGGAGCGTGGCAGG-5 3-GCGACCATAGTGATTTAGA-5
3-GCGACCATANTGATTTAGA-5(N = A, T或者C)
、、
3 -GCGTCCATAGTGATTAAGA-5 、、3 -GCGTCCATGATGATTAAGA-5
、
、
、、
完全匹配 单碱基错配 两碱基错配 四碱基错配 非互补
3-CCGTCCCCAGTGATTAAGT-5
、、
3 结果和讨论
3.1 非标记分子信标的设计
如图1所示，非标记分子信标是由一个小的荧光分子组成的，含有47个核苷酸的DNA链（M1），并含有15个核苷酸的DNA链（S1）。S1链是15个碱基序列互补的（斜体M1由15个碱基构成）在M1末端的3、上。M1/S1合成体，是由胞嘧啶的相反的缺口位点组成，一个发夹结构（下划线基地M1）组成的6个碱基对干和19个环序列（斜体下划线的基地和M1写），是由退火溶液M1（2μm）和S1（2μm）构成的。把2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶（2μm）添加到M1 /S1复合溶液形成更复杂的M1 / S1 / 2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶溶液。上面描述的就是非标记分子信标的设计，称之为GSMB。通过对2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶的实验，不成对的胞嘧啶将会在S1/M1复杂的缺口位点紧密结合，导致其荧光猝灭。一个打开的发夹结构将会从GSMB中释放出2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶。 3.2 GSMB探针的表征
为了证明所示的方法的可行性，我们评估了GSMBs的荧光在遗传微粒上的缺失以及在目标基因变化后的荧光情况。图2显示了2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶的荧光光谱（2μm）在含有100mM 氯化钠和1mM四乙酸二氨基乙烯的10mM的二甲胂酸钠缓冲溶液变化情况。在M1/S1分子的复杂结构情况下，2-氨基-5,6,7-
5
三甲基-1,8-萘啶荧光表现出的发射波段在401nm处的和最多（曲线a）。然而，2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶除了比M1/S1分子结构复杂外（图2，曲线b），其荧光表现出显著的猝灭现象，2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶的荧光从201u减少到11u。在2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶的荧光强度略有下降时，观察到一个ss的M1，S1或完全匹配的双链的存在。一个小的荧光分子可以通过氢键的为成对碱基结合在DNA双链上。这导致分子的荧光猝灭。这些结果表明，2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶纳入M1/S1分子结构的复合物的干基部分的缺口位点中，是通过氢键来结合胞嘧啶的。在对GSMBs的其他的cDNA的反应进行研究，如图2所示，在加入1.5μM的目的cDNA 后，2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶的荧光强度在恢复了13倍(图2，曲线c)。当可以被分配到另外的目标时，增加回收2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶荧光的强度。
250200发光强度150100500350360370380390400410420430440450460470480490500510波长(nm)
图2 加入M1/S1复合物前后ATMND的荧光光谱
Fig. 2. Fluorescence spectra of ATMND before (a) and after bound to M1/S1 complex to form GSMB (b). (a) ATMND alone (2.0 μM); (b) GSMB (ATMND (2.0 μM) in the presence of M1/S1 complex (2.0 μM)). Spectra (c) is ?uorescence spectra of GSMBs (M1/S1/ATMND complex, 2.0 μM) in the presence of target cDNA (1.5μM). Sample solutions were adjusted to pH 7.0 with 10
mM sodium cacodylate containing 100 mM NaCl and 1 mM EDTA.
为了定量地确定2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶胞嘧啶在缺口位点的M1/S1的复杂情况，对2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶的荧光滴定法进行了研究。在401nm处的荧光强度所产生的变化提供了一个按1:1[1/S1分子结构复杂]/[2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶]的测定终点，说明2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶形成了稳定的1：
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1的复合物与M1/S1复杂的缺口位点。结合常数K值8.1×106M-1，在本实验滴定曲线测定下，得出2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶含有不共价结合的DNA。
这种非标记分子信标采用“信号”的方法，重点考虑的是让灵敏度达到最高。作为常识，宏块的灵敏度可以通过增加荧光团的强度或提高猝灭剂的效率提高。一个小的荧光分子可以捆绑到一个未成对的基地，这就是侧翼的结合位点的碱基与一个未成对碱的氢键和堆叠。因此2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶的荧光猝灭效率可能会受未成对的胞嘧啶在复杂的M1/S1的缺口位点的影响，即使在2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶和胞嘧啶碱基之间有互补的氢键，也无法避免。为了检查侧翼碱基上荧光猝灭的效果，我们研究了2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶序列在一个单一的胞嘧啶M1/S1复杂干部分的依赖性结合的缺口位点。如图2所示，最强的淬灭是2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶绑定的M1/ S1复杂的具有GG碱基对在5、和3、侧间隙站点（图3），在401nm处的荧光强度猝灭高达95%，在基准2.0μM处，M1/S1分子结构复杂。对于其他的侧链碱基（图3，光谱b-e），观察到的荧光猝灭是相对稳定的，在那儿的顺序是T-T(74%) 200 180 荧光强度 160 140 120 100 80 60 40 20 0 420 440 460 480 波长 图3 侧链碱基对探针识别性能影响的考察 380 400 500 a a:ATMND b:-TCT-/-A.A- c:-GCG-/-C.C- d:-/-T.T- e:-CCC-/-G.G- Fig. 3. Fluorescence spectra of ATMND (2.0μM) in the presence of 2.0μM M1/S1 complex with different ?anking bases. 这些结果表明，虽然在2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶和胞嘧啶碱基之间互补的氢键发挥了很重要的作用，但是缺口位点依然对荧光猝灭效率产生了影响。所以在GSMs中我们选择5、和3、的GS缺口位点。在紫外线范围内的CD光谱可以用 7 来监测DNA的构象转变。如果确定的构象发生变化，结合后的2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶在M1／S1复杂的茎部分的缺口位点，镉的实验进行了M1/S1复杂之前和之后的2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶结合。在没有2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶和遗传微粒时，M1/S1分子结构的复合物显示在250nm处取得负峰值，在275nm处取得正峰值，这是在一个茎部分的螺旋特征的β-构象。而添加2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶后，在M1/S1/2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶没有观察到明显的复杂诱导CD（GSMBs）,表明2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶与胞嘧啶碱基的结合，茎的部分的缺口位点不诱导M1／S1复杂的的构象变化。因此，它不影响靶DNA的杂交动力学。我们推断在250nm处的CD峰值的增加是由于GSMB环遗传微粒的长螺旋线形成的。 3.3 使用非标记分子信标检测目标DNA 由于2-氨基-5,6,7-三甲基-1,8-萘啶的荧光猝灭效率与浓度和M1/S1分子结构有关系，为了优化条件，我们选择2μM的浓度，实现了良好的灵敏度。在最佳条件下，在校准曲线的基础上获得三组平均测量值（图4）。 荧光强度 220 200 180 160 140 120 2μM 100 50nM 80 60 40 20 波长 图4 目标链的浓度与ATMND荧光强度关系图 Fig.4. Fluorescence spectra of a GSMB after hybridization with (from up to down) 2.0, 1.5, 1.0, 0.5, 0.3, 0.2, 0.1, 0.05, and 0 μM of cDNA, respectively. 0 360 420 440 460 480 400 500 如上图所示，正如预期的那样，当信号增强时，观察到荧光强度在50nM到1.5μM的范围内，与cDNA浓度成正比。线性回归方程为I = 11+81c(μM)(r=0.9923), 8
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