2021届高中生物竞赛实验辅导讲义
生物化学实验
（基础部分）
实验六 蛋白质的水解和氨基酸的纸层析法分离
一、目的
1．学习水解蛋白质的方法。 2．掌握纸层析的基本技术。
3．学习用纸层析分离、鉴定氨基酸的方法。
二、原理
1．蛋白质的水解
蛋白质可以用酸、碱或酶如胃蛋白酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶水解成最终产物氨基酸。实验室中常使用酸解法水解蛋白质。当在6 mo叭。盐酸溶液中将蛋白质在110t加热大约20 h，肽键断裂，此时蛋白质完全分解为氨基酸。
酸法水解蛋白质的优点是在水解过程中不发生外消旋作用，所得到的氨基酸均为L一氨基酸。大多数氨基酸在煮沸酸中是稳定的，但色氨酸则完全被破坏。丝氨酸和苏氨酸在酸解过程中或多或少地也有破坏。色氨酸的水解产物已知是一种棕黑色的物质——腐黑质，因此，用酸法水解蛋白质得到的水解液为棕黑色的。
2．纸层析法分离氨基酸
纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析法。它利用不同物质在同一推动剂中具有不同的分配系数，经层析而达到分离的目的。在一定条件下，一种物质在某溶剂系统中的分配系数是一个常数，若以K表示分配系数
层析溶剂（又称推动剂），是选用有机溶剂和水组成的。滤纸纤维素与水有较强的亲和力（纤维素分子的葡萄糖基上的-OH基与水通过氢键相作用）能吸附很多水分，一般达滤纸重的22％左右（其中约有6％的水与纤维素结合成复合物），由于这部分水扩散作用降低形成固定相；而推动剂中的有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可在滤纸的毛细管中自由流动，形成流动相。层析时，点有样品的滤纸一端浸入推动剂中，有机溶剂连续不断地通过点有样品的原点处，使其上的溶质依据本身的分配系数在两相间进行分配。随着有机溶剂不断向前移动，溶质被携带到新的无溶质区并继续在两相间发生可逆的重新分配，同时溶质离开原点不断向前移动，溶质中各组分的分配系数不同，前进中出现了移动速率差异，通过一定时间的层析，不同组分便实现了分离。物质的移动速率以Rf值表示：
各种化合物在恒定条件下，层析后都有其一定的Rf值，借此可以达到定性、鉴别的目的。
溶质的结构与极性、溶剂系统的物质组成与比例、pH值、滤纸的质地以及层析的温度、
时间等都会影响Rf值。
三、仪器试剂和材料
1．仪器
（1）干燥箱 （2）水浴锅 （3）安培瓶 （4）层析缸 （5）吹风机 （6）喷雾器 2．试剂
（1）6mol／L HCl
（2）标准氨基酸（lml／mL）：称取亮氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、组氨酸
各lmg，分别溶于lml 0.01mol／L的HCl溶液中，保存于冰箱
（3）展层剂：正丁醇：88％甲酸：水＝15：3：2（V／V） （4）0.5％的茚三酮丙酮溶液 （5）10％异丙醇溶液 3．材料
（1）层析滤纸（10cm × 10cm），普通滤纸（21cm × 21cm） （2）毛细管、培养皿、镊子 四、操作步骤
1．蛋白质的水解
称取0．Zg酵母粉，放进一个小安培瓶中，向瓶中加入l ml 6mol／L的盐酸，于喷灯火焰上封口。将安培瓶放入干燥箱内，在110℃下水解20 h后，把安培瓶内的水解液倒进蒸发皿内，将蒸发皿放于沸水浴上加热以除去水解液中的盐酸。将水解液蒸干，溶解于0.5—l ml 10％的异丙醇中。
2．纸层析法分离氨基酸
取 1张 10 × 10cm的层析滤纸放在普遍滤纸上，用直尺和铅笔在距滤纸底边2 cm处划一条平行于底边的很轻的直线做为基线。沿直线以一定的间隔做标记以指示标准氨基酸和蛋白质水解液的加样位置。用毛细管吸少量氨基酸样品点于标记的位置上。点样时，毛细管口应与滤纸轻轻接触，样点直径一般控制在0.3cm之内。用吹风机稍加吹干后再点下一次，重复3次，每次的样品点应完全重合。加样完毕后，将滤纸卷成圆筒状，使基线吻合，两边不搭接，用针和线将纸两边缝合。将点好样品的滤纸移入层析缸中（层析缸内事先加入一个注人40ml展层剂的直径为10cm的培养皿，使液层厚度为1cm左右，盖上层析缸的盖子20min，以保证罩内有一定蒸汽压），采用上行法进行展层。当溶剂前沿上升到距纸上端Icm时，取出滤纸，立即用铅笔记下溶剂前沿的位置，剪断缝线，用吹风机吹干滤纸上的溶剂。之后用前三酮丙酮溶液均匀地喷洒在滤纸有效面上，切勿喷得过多致使斑点扩散。然后将滤纸放入烘箱，于80℃下显色5min后取出。
五、结果处理
用铅笔轻轻描出显色斑点的形状，并用一直尺度量每一显色斑点中心与原点之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，计算各色斑的Rf值，与标准氨基酸的Rf值对照，确定水解液中含有哪些氨基酸。
六、注意事项
1．点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面（即展层时样品可能达到的部分）。 2．点样斑点不能太大（直径应小于0.3 cm），防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，且吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。
3．展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。
4．作为展层剂的正丁醇要重新蒸馏，甲酸须用分析纯的。且展层剂要临用前配制，以免发生酯化，影响层析结果。
5．如果样品中溶质种类较多，且某些溶质在某一溶剂系统中的Rf值十分接近时，单向层析分离效果不佳，则可采用双向层析，即将样品点在一方形滤纸的角上，先用一种溶剂系统展层。滤纸取出干燥后，再将滤纸转90度角，用另一溶剂系统展层。所得图谱分别与这两种溶剂系统中作的标准物质层析图谱对比，即可对混合物样品中各成分进行鉴定。
七、思考题
l．为什么点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面？ 2．影响物质移动速率几值的因素有哪些？ 参考文献
文树基。主编基础生物化学实验指导．西安：陕西科学技术出版社，1994
2021届苏高中生物竞赛实验辅导讲义-生物化学实验(基础)05蛋白质的水解和氨基酸的纸层析法分离
