目的：筛选与启动子pHIS2-A互作的蛋白。
方法：以启动子A构建到酵母单杂交启动子载体pHIS2，文库质粒为pGADT7-中山杉文库。
材料：
1．启动子克隆：pHIS2-A。根据实验需求进行扩增并酶切构建载体，两端的EcoRI和
SacI酶切位点，序列如下：
GAATTCAGTTGGAATCACATCTATCATCAGAATGAAAGACCTAAGAAAAAAATGGCA
TATAAAAATATGAAAGATTGTTTTTTTTTAACTGATGACCCACATATTTTTTTAATCTGTTCAACTAAAAAAACTTCTGAACGAGCTC
通过启动子序列两端的酶切位点构建到酵母单杂交启动子载体pHIS2上。 2．启动子载体：pHIS2 3．prey载体：pGADT7 4．CLONTECH酵母单杂交系统 5．培养基：
1). 酵母完全培养基：
YPDA：1% Yeast extract，2% Tryptone，2% Glucose, 0.02% Adenine。 2). 酵母缺陷型筛选培养基：
参照Clontech公司的PT3024-1/ Yeast Protocols Handbook。其中各种培养基分别以下列符号表示：
SD-T：-trp； SD-TH：-trp,-his；
SD-TL：-trp, -leu； SD-TLH：-trp, -leu, -his； 1.1 酵母转化反应
反应
1 2
—— pGAD53m
pHIS2-A PHIS2-p53
AD质粒
pHIS2质粒
板
SD-T SD-TL
SD-TH+3AT
SD-TLH+3AT
1.2 酵母感受态制备及转化方法
1. 从YPDA平板挑取Y187单菌落接种于YPDA液体培养基4 ml，30℃，225 rpm，振荡培养18-20 h（过夜），至OD600>1.5，一般为4左右。
2. 转接YPDA液体培养基，培养体积为50 ml，使初始OD600 = 0.2，30℃，225 rpm，振荡培养4-5 h，至OD600 = 0.6。
3. 离心收菌，室温，1,000 rpm，5 min。
4. 用20 ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，1,000 rpm，5 min，弃上清。 5. 用5 ml 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，1,000 rpm，5 min，弃上清。
6. 用500 ul 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，分装至1.5 ml离心管，50 ul/每管（一个转化），备用。
背景筛选检测&筛库
阳性对照
转化平
检测平板
检测内容
7. 每个1.5 ml离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1 min左右，至完全混匀。
50%PEG3350
1 M LiAc 36 ul
ssDNA(10 mg/ml)
质粒DNA 各5 ul
240 ul 5 ul
8. 30℃水浴孵育，30 min。 9. 42℃水浴热激，25 min。 10. 30℃水浴复苏，1 h。
11. 离心收菌，室温，700 rpm，5 min，弃上清。
12. 每个转化用200 ul无菌水悬浮菌体，尽量温和地混匀，涂布相应的缺陷型筛选平板。
13. 30℃恒温培养3-4天。 1.3 自激活检测
分别从3个转化反应的平板上各随机挑取3个单菌落，稀释后涂板至对应的不添加histidine、但添加不同浓度（0、10、20、30、40、50、75 mM）3AT的缺陷型平板上，30℃恒温培养3天。
反应 转化平板 检测平板 检测内容 pHIS2- A SD-T SD-TH 背景筛选检测
PHIS2-p53+pGAD53m SD-TL SD-TLH 阳性对照 3AT是酵母HIS3蛋白合成的竞争性抑制剂，用于抑制His3基因的泄漏表达。 实验结果如下：
图1：背景筛选结果
结果分析：
阳性对照由于HIS3报告基因的激活，理论上在添加3AT抑制剂的平板上能正常生长不受影响，转化子数量与不添加3AT相同，但是实际观察到的生长值是比不添加3AT的平板约有10%的降低，并且随着3AT浓度增加，生长率会降低。
由自激活检测结果看出，在添加10 mM 3AT的平板上转化子生长没有菌落生长，显示未激活HIS3报告基因，因此决定在10 mM 3AT的基础上进行酵母单杂筛选。
第二部分酵母单杂交筛库
用含有正确pHIS2-A诱饵质粒的Y187酵母转化子作为受体菌制备感受态，将文库质粒pGADT7-中山杉文库质粒DNA转入其中，涂SD-TLH + 10 mM 3AT平板。
2.1 文库DNA转化方法：
1. 从SD-T平板挑取单克隆菌种接于液体SD-T培养基50 ml，30℃，225 rpm，振荡培养18 h。
2. 转接于YPDA液体500 ml，使初始OD600=0.2，30℃，225 rpm，振荡培养4-5 h，至OD600=0.6。
3. 离心收菌，室温，1,000 rpm，5 min。
4. 用30 ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，1,000 rpm，5 min，弃上清。 5. 用20 ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，1,000 rpm，5 min，弃上清。
6. 用10 ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，1,000 rpm，5 min，弃上清。
7. 向离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1 min左右，至完全混匀。
50%PEG3350
1 M LiAc
1.44
9.6 ml
ml
8. 30℃水浴孵育，30 min。 9. 42℃水浴热激，25 min。 10. 30℃水浴复苏1 h。
11. 离心收菌，室温，1,000 rpm，5 min，弃上清，用 8 ml无菌水重悬菌体，尽量温和地混匀，从中取20 ul培养物梯度稀释后涂效率平板SD-TL 1块。其余涂SD-TLH + 10 mM 3AT共15块。
12. 30℃恒温培养3-4天，观察转化结果。
300 ul
25 ug
ssDNA mg/ml)
(10
文库质粒DNA
第四部分筛库结果
将上述SD-TLH + 10 mM 3AT筛库平板上长出的初始阳性性转化子划线于SD-TLH+ 10 mM 3AT选择平板，30℃恒温培养3-4天。
图片结果如下：
图2.筛库结果
注：（+）为阳性对照pGAD53m+pHIS2-p53
筛库结果：筛库的SD-TLH+ 10 mM 3AT平板上长了192个单克隆菌落。 第五部分酵母阳性克隆PCR鉴定、测序及blast比对
为了鉴定筛选到的阳性克隆分别是什么基因，需要从酵母细胞中扩增出这些阳性克隆进行DNA测序，并与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对分析。
注：扩增阳性克隆使用的是南京瑞源生物技术有限公司自主研发的一款快速扩增酵母阳性克隆试剂盒(Yeast Colony Rapid Detection Kit，货号：RY8001)。
测序比对结果
192个阳性酵母克隆，全部PCR扩增，达到测序要求的有78个，测序成功78个，经过Seqman、BLAST比对，去除空载和重复序列最终获得63个不同的序列。
第六部分酵母阳性克隆回转验证
将上述划线于SD-TLH+ 10 mM 3AT缺陷型平板上长出的阳性克隆转化子分别用无菌水稀释后点至SD-TL、SD-TLH、SD-TLH + 10 mM 3AT缺陷平板，30℃恒温培养3-4天。
图3.回转验证
注：（+）为阳性对照pGAD53m+ pHIS2-p53
回转验证结果：筛选得到的63个阳性克隆，所有阳性克隆均能在SD-TL、SD-TLH、SD-TLH + 10 mM 3AT缺陷型平板上生长。
南京瑞源生物技术有限公司坐落于南京市栖霞区生命科技园，专注于基因组高通量研究领域，致力于生物高科技研发，目前产品的技术水平已达到省级实验水平，瑞源生物立足于生命科学，为基础研究领域科学工作者提供生物学技术服务，自2019年创立以来，全体员工致力于利用酵母系统研发新药物靶点，专注于生物学研究，长期与全国各大农林/医药院校在大型科研技术研发上紧密合作。目前已经成熟的产品线如下:酵母文库的构建、酵母双杂交筛选体系酵母单杂交筛选体系、酵母菌落快速鉴定试剂盒、酵母质粒快速抽提试剂盒、蛋白质免疫沉淀检测服务、酵母体系非生物胁迫抗逆性筛选以及 CUT&Tag服务等。
新-酵母单杂交筛选与启动子pHIS2-A互作蛋白结题报告
