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第三节 微生物的分类鉴定方法
一、微生物鉴定的依据
获得纯化的微生物分离菌株后，首先判定是原核微生物还是真核微生物，这实际上在分离过程中所使用的方法和选择性培养基已经决定了分离菌株的大类的归属，从平板菌落的特征和液体培养的性状都可加以判定。然后，如是原核微生物，便可根据表 14-3 所示的经典分类鉴定指标进行鉴定，如条件允许，可做碳源利用的 BIOLOG-GN 分析和 16S rDNA 序列分析。多项结果结合起来确定分离菌株的属和种。
表 14-3 微生物经典分类鉴定方法的指标依据
经 典 分 类 法 个体：细胞形态、大小、排列方式，染色反应，有无运动，各种特殊构造特征等 形态特征：菌落形态，在固体、半固体或液体培养基中的生长状态等 营养要求：碳源、氮源、矿质元素、生长因子等 生理生化特征：代谢产物种类、产量、显色反应等 酶：产酶种类和反应特征等 生态学特性：生长温度，对氧的需要，酸碱度要求，宿主种类，生态分布等 血清学反应 噬菌体的敏感性 其他 二、微生物鉴定的技术与方法
根据目前微生物分类学中使用的技术和方法，可把它们分成四个不同的水平：①细胞形态和行为水平，②细胞组分水平，③蛋白质水平，④基因组水平；
在微生物分类学发展的早期，主要的分类鉴定指标是以在细胞形态和习性为主，可称为经典的分类鉴定法。其他三种实验技术主要是 60 年代以后采用的，称为化学分类和遗传学分类法，这些方法再加上数值分类鉴定法，可称为现代的分类鉴定方法。
（一）、经典分类鉴定法
经典分类法是一百多年来进行微生物分类的传统方法。其特点是人为地选择几种形态生理生化特征进行分类，并在分类中将表型特征分为主、次。一般在科以上分类单位以形态特征、科以下分类单位以形态结合生理生化特征加以区分。最后，采用双歧法整理实验结果，排列一个个的分类单元，形成双歧检索表（图 14-4 ）。
A. 能在 60 o C 以上生长
B. 细胞大，宽度 1.3~1.8mm ……………………………………… 1. 热微菌属 ( Thermomicrobium ) 精品文档
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BB. 细胞小，宽度 0.4~0.8mm C. 能以葡萄糖为碳源生长
D. 能在 pH4.5 生长 …………………………………………… 2. 热酸菌属 ( Acidothermus )
DD. 不能在 pH4.5 生长 ………………………………………………… 3. 栖热菌属 ( Thermus )
CC. 不能以葡萄糖为唯一碳源 ……………………… 4. 栖热嗜油菌属 ( 栖热嗜狮菌属 Thermoleophilum )
AA. 不能在 60 o C 以上生长
图 14-4 双歧法检索表例样
应用 BIOLOG-GN 仪检测分离菌株对众多碳源的利用情况判断分离菌株的分类地位，近年来也时有应用。在 BIOLOG-GN 仪上有 96 个小孔，其中 95 孔内分装有 95 种不同碳源的缓冲液， 1 孔为无碳源的缓冲液对照，各孔接入适宜菌浓度和液量的分离菌株培养物，定温培养，每日定时读取 BIOLOG-GN 仪计算机上各碳源利用情况，一般为时 1 周， BIOLOG-GN 仪可显示出该鉴定菌株的最可能归属。
（二）、数值分类法
又称阿德逊氏分类法 () 。它的特点是根据较多的特征进行分类，一般为 50 ～ 60 个，多者可达 100 个以上，在分类上，每一个特性的地位都是均等重要。通常是以形态、生理生化特征，对环境的反应和忍受性以及生态特性为依据。最后，将所测菌株两两进行比较，并借用电子计算机计算出菌株间的总相似值，列出相似值矩阵 ( 图 14-5) 。为便于观察，应将矩阵重新安排，使相似度高的菌株列在一起，然后将矩阵图转换成树状谱
(dendrogram)( 图 14-6) ，再结合主观上的判断 ( 如划分类似程度大于 85 ％者为同种，大于 65 ％者为同属等 ) ，排列出—个个分类群。
图 14-5 显示 6 个细菌菌株的遗传相似矩阵图
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图 14-6 根据相似矩阵图转换的相似关系树状谱
数值分类法的优越性在于它是以分析大量分类特征为基础，对于类群的划分比较客观和稳定；而且促进对细菌类群的全面考查和观察，为细菌的分类鉴定积累大量资料。但在使用数值分类法对细菌菌株分群归类定种或定属时，还应做有关菌株的 DNA 碱基的 G + Cmol% 和 DNA 杂交，以进一步加以确证。
（ 三）、化学分类法
微生物分类中，根据微生物细胞的特征性化学组分对微生物进行分类的方法称化学分类法 (chemotaxonomy) 。在近二十多年中，采用化学和物理技术采研究细菌细胞的化学组成，已获得很有价值的分类和鉴定资料，各种化学组分在原核微生物分类中的意义见表 14-4 。
表 14-4 细菌的化学组分分析及其在分类水平上的应用 细胞成份 细胞壁 分析内容 肽聚糖结构 多糖 胞壁酸 膜 脂肪酸 极性类脂 霉菌酸 类异戊二烯苯醌 蛋白质 氨基酸序列分析 血清学比较 电泳图 酶谱 代谢产物 脂肪酸 热解 — 质谱分析 随着分子生物学的发展，细胞化学组分分析用于微生物分类日趋显示出重要性。细胞壁的氨基酸种类和数量现己被接受为细菌属的水平的重要分类学标准。在放线菌分类中，细胞壁成分和细胞特征性糖的分析作为分属的依据，已被广泛应用。脂质是区别细菌还是古菌精品文档
种和属 全细胞成分分析 热解—气液色谱分析 种和亚种 属和属以上单位 种和属 在分类水平上的作用 种和属
微生物分类鉴定讲课教案
