分子生物学技术
近年来，心血管疾病的发病率和死亡率急剧增加，已成为危害我国人民群众生命和健康的重大疾病。人们逐渐认识到,包括心血管疾病在内的许多疾病的生理、病理机制的本质问题是相关基因的表达及其调控。随着研究的深入, 心血管疾病的研究已深入到分子生物学水平。人们寻找疾病相关基因, 研究其表达调控机制, 希望在分子水平阐明疾病发生机制, 以期更有效地进行疾病的诊断、治疗。相应地, 很多分子生物学研究技术也应用到对心血管疾病的研究中来, 成为不可或缺的基本手段, 如分子杂交技术、聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction，PCR）技术、反义核酸技术、DNA 微阵列、转基因技术等等。分子诊断学是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据的一门学科。1953 年 Watson & Crich 发现 DNA 双螺旋结构, 标志着分子生物学时代的到来。随着研究的进展, 人们对心血管疾病的研究也逐步深入到分子水平, 很多分子生物学的研究技术也在疾病机理、药物机理的研究中广泛应用, 成为基本的研究手段。人类基因组计划完成后, 生命科学研究进入后基因组时代, 进行功能基因组学、蛋白质组学的研究, 相应的实验技术也广泛应用并不断发展。
在过去的短短的10余年中,检验医学发展日新月异、发展迅猛,临床实验室的实验设备已高度自动化及网络化，“实验室全自动化”（Total Laboratory Automation,TLA）、分子诊断（MolecularDiagnostics）、床旁检验（Point of Care Tests,POCT）、循证检验医学（Evidence basedlaboratory medicine,EBLM）的兴起为心血管疾病的诊疗提供了极大帮助。 一、分子生物学技术
由于分子生物学技术的快速发展,以及人类基因组序列认识的逐渐完善,以PCR为代表的体外核酸扩增技术已在临床基因诊断中得以较为广泛的应用,如病毒、细菌的基因快速检测,遗传性疾病的诊断,肿瘤的基因诊断等。实时荧光定量PCR技术的应用,不仅使临床基因检测更加快速,而且使基因检测进入定量阶段,这特别有利于某些疾病治疗效果的评价。免疫检验中的放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA）,酶免疫分析（Enzyme Iimrrmnoassay，EIA）,金标记免疫分析,荧光免疫分析（Fluoroimmunoassay，FIA）,时间分辨荧光免疫分析（Time-resolved Fluoroimmunoassay，TRFIA）,化学发光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay，CLIA）,电化学发光免疫分析（Electro-Chemiluminescence Immunoassay ，ECLI）技术的临床应用不仅拓宽了免疫学检测的领域,同时提高了免疫学检测的灵敏度,促进了免疫检测的自动化。特别是化学发光免疫分析、电化学发光免疫分析技术的诞生,使得免疫学检验进入了一个新的时代,检测灵敏度可达pg水平,其检测速度、分析自动化程度及分
析准确性也是其它免疫学方法无法比拟的。流式细胞术进入临床实验室极大地拓宽了临床检验的范围,可应用于细胞DNA、RNA定量及细胞周期分析、细胞表面标志物分析、凋亡细胞的检测等,促进了细胞生物学的临床应用。
生物芯片技术是生命科学研究中继基因克隆技术、基因自动测序技术、PCR技术后的又一次革命性技术突破。生物芯片已在高通量基因测序、基因表达研究已经发挥了其重要作用,也将在后基因组时代研究蛋白质功能及蛋白质间的相互作用方面发挥其极其重要的作用。由于生物芯片具有高通量、可同时快速检测多种待检分子的特点,故研究适用于临床实验诊断需要的低密度生物芯片近年来已成为检验医学的研究热点之一,用于肝炎病毒、HPV检测及分型、结核分枝杆菌、人巨细胞病毒、幽门螺杆菌、地中海贫血、性传播性疾病等的检测及诊断的基因芯片已相继问世;用于微量蛋白质、激素、肿瘤标志物监测的蛋白质芯片也已得到初步应用。
分子诊断就是利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。分子诊断以基因作为检查材料和探查目标，属于“病因诊断”针对性强。目前已经能够进行分子诊断的疾病包括:①染色体疾病的诊断和产前筛查。②单基因遗传病的分子诊断和产前诊断。单基因遗传疾病是由单个基因发生突变引起的疾病。已发现的人类单基因遗传病多达400种以上。目前,已经了解许多单基因遗传疾病的致病基因以及发病机制,如Marfan综合征、先天性肾上腺皮质增生症、糖原累积症、家族性高胆固醇血症。③多基因疾病的分子诊断。多基因疾病是危害人类健康的多发病、常见病,如恶性肿瘤、心血管疾病（动脉粥样硬化、高血压等）、糖尿病、精神-心理疾病（精神分裂症、忧郁症等）。这些疾病的分子病因十分复杂,可采用已知基因标志的连锁分析和关联分析方法,对未患病个体进行患病危险性预测,以及对上述疾病进行亚型的基因分型和鉴定等辅助诊断,以利于疾病的正确治疗。④感染性疾病的基因诊断。⑤恶性肿瘤的分子诊断。 二、心血管疾病检测常用的分子生物学技术
心血管疾病是一种与多基因有关的复杂疾病，其发生、发展与多基因位点变异及表达异常有关。高血压、冠心病等心血管疾病, 是由于环境与遗传因素相互作用引起, 涉及多基因的参与, 机制复杂, 分离与克隆相关基因是了解这些疾病机理的基础。研究相关细胞和组织在生理、病理或药物处理状态下的基因表达谱, 分析基因表达差异, 可以为筛选疾病候选基因, 阐释疾病的机理提供重要信息。
分子诊断的常用技术方法有：①核酸分子杂交技术，包括Southern印迹（Southern blot杂交），Northern印迹（Northern blot杂交），斑点杂交（dot blot），原位杂交（insituhybridization）等；②PCR及相关应用技术，包括等位基因特异寡核苷酸探针（Allele Specific Oligoneucliotides，ASO）杂交法、单链构象多态（Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP）分析、DNA限制性片段长度多态性（Restrictionfragment Length Polymorphism，RFLP）分析、微卫星DNA
分析技术等。③基因测序是基因突变检测的最直接最准确的方法它不仅可确定突变的部位还可确定突变的性质。④基因组学及分析技术，包括基因芯片、DNA微阵列（DNA microarray）技术等，利用核酸分子杂交原理，可用于大规模筛选和基因表达研究。⑤蛋白质组学及分析技术，作为功能基因组研究的重要支柱，研究的是在不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体，从而揭示和说明生命活动的基本规律。⑥荧光原位杂交染色体分析技术（FISH），这项实用技术不仅可用于基因在染色体上的定位研究，而且可直接用于实验室诊断。⑦波谱核型分析技术（Spectral karyotyping，SKY）主要用于肿瘤细胞的遗传学分析，检测复杂的细胞遗传学异常，也可用于比较细胞遗传学的种间进化差异性研究等方面。⑧分子生物学相关技术的发展及作用，其中应用较多的有：一是毛细管电泳技术（capillary electrophoresis，CE）现已广泛应用于病原体、肿瘤和遗传病的基因诊断，如病原体特异基因检测、基因突变检测、序列分析等；二是液质联用质谱技术（LC/MS/MS），可在短时间内通过检测血液中氨基酸或酰基肉碱水平异常可快速筛选出近30种基因遗传性代谢紊乱疾病在多肽、激素、寡核苷酸以及药物成分分析等方面应用广泛；三是变性高效液相色谱技术，可自动检测单碱基替代及小片段核苷酸的插人或缺失。
（一）DNA 微阵列（ DNA microarrays）
DNA微阵列（DNA microarrays）广泛应用于基因的序列分析、基因组图谱分析、基因突变与基因多态性分析以及疾病的基因诊断等方面。1999年基因微阵列技术应用于心血管系统的研究以来,在心血管病相关基因差异表达分析、疾病分子分型、基因突变检测和多态性分析等方面取得了一些进展。 DNA微阵列也叫DNA芯片、基因芯片（genechip），将数以万计的DNA探针固化于支持物表面上,产生二维DNA探针阵列,然后与标记的样品进行杂交,通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、并行、高效的检测或医学诊断。由于常用硅芯片作为固相支持物,运用了计算机芯片的制备技术,所以称之为基因微阵列或基因芯片技术。其基本原理是分子杂交,类似于Southern和Northern印迹杂交技术,通过探针与固定于芯片上的大量cDNA、表达序列标签（Expressed Sequence Tags，EST）或寡核苷酸的杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量，具有高通量、简便、微缩、集约化、平行化等优点。
基因表达谱芯片和基因诊断芯片是基因芯片的两种重要形式,前者可以提供待测组织的基因表达谱,即组织中基因整体的表达情况;后者则主要是通过检测疾病相关基因突变或者表达改变等信号来诊断疾病的发生。
人类共有35000多个基因,2001年哈佛大学附属医院心血管研究中心用3种统计方法确定了26000多个与人类心血管系统有关的基因,结果表明与人类心血管系统有关的基因占人体基因的3/4,这也是全世界第一次建立这样的基因库。并确定了200多个与心功能衰竭有关系的病态基因。心血管系统生理功能和病理改变的分子机制十分复杂,与心血管系统生理和病理过程相关的信号转导系统也是一个综合的调控网络,其状态的描述是传统的单因素研究理论和方法所不能承担
的,需要借助复杂系统的研究理论和方法来完成。而以往对心血管疾病的研究,都是采取一种疾病用一个基因检测的传统方法,存在诸多不便,不能满足当前医学领域飞速发展的需求。而微阵列芯片利用高度集成的cDNA/EST片段或寡核苷酸微阵列,使大规模、高通量同时检测成千上万种组织或细胞内的基因的表达成为可能,达到了一定意义上的全基因表达谱的检测。EST是长150～500bp的基因表达序列片段,EST技术是将mRNA反转录成cDNA并克隆到载体构建成cDNA文库后,大规模随机挑选cDNA克隆,对其5′或3′端进行一步法测序,所获序列与基因数据库已知序列比较,从而获得对生物体生长发育、繁殖分化、遗传变异、衰老死亡等一系列生命过程认识的信息。心血管系统基因组DNA数目庞大,含有重复序列和非编码序列,如完全采用克隆筛选和排列的方法获得其编码基因序列,大量的时间和精力将被消耗在模板DNA的制备上。因此采用此技术在短期内即得到大量来自cDNA文库的表达序列,即表达标签序列（ESTs）,将其制备成ESTs微阵列是目前寻找和发现新基因及心血管疾病相关基因的快速有效方法。
目前,在心脏的研究中,微阵列芯片技术主要用于检测心肌重塑模型（包括缺血损伤、拟神经递质/激素刺激造成的心肌重塑和不同发育阶段的心肌重塑等模型）的基因表达谱、病毒性心肌炎的针对治疗及心血管疾病的基因表达差异与病理状态下分子机制的研究等方面。
DNA微阵列技术近年被应用于冠状动脉疾病、心肌梗死、心衰和一些先天性心脏病的研究中, 用来比较患者的基因表达差异, 也用于研究内皮细胞、血管平滑肌细胞、免疫细胞在心肌梗死、冠状动脉疾病中的变化。 （二）基因表达序列分析（Serial Analysis of Gene Expression, SAGE）
SAGE 技术最初由 Velculescu 等人建立, 与微阵列技术一样, SAGE 技术可同时扫描上千个基因的表达, 可获得完整的转录谱, 是一个非常有效的分析基因表达的方法。
SAGE 技术基本原理是, 在一个基因转录本内部特定位置上, 有能代表一个基因的短序列标签,多个 SAGE 标签连结在一起, 连到克隆载体上, 测序。每个 SAGE 标签理论上代表一个转录本, 基因表达差异可以通过比较特定 SAGE 标签在不同文库间表达丰度的差异来表示。相对于微阵列技术,SAGE 在心血管疾病研究中的应用还是较为有限。
目前, 正常人心脏的 SAGE 文库已经建立, 也有报道建立了正常鼠心脏的基因表达谱。在心血管发育、动脉粥样硬化、脂代谢调节等许多领域都可应用 SAGE 技术。在 Schwartz 等的研究中, 利用 SAGE 技术识别鼠心脏血管紧张素Ⅱ（ANGⅡ）调节靶位点, 发现了一些新的 ANGⅡ调节靶位点。 （三）代表性差异分析 （representational difference analysis of cDNA, cDNA RDA） Hubank 等 1994年建立 cDNA RDA 技术。之后 cDAN RDA 被广泛应用于各个领域的基因克隆, 如肿瘤特异基因、分化相关基因、器官特异基因、刺激信号诱导表达基因等。这项技术的原理为: 用识别4个碱基的限制性内切酶对双
链cDNA进行消化, 理论上将产生平均大小为256bp 的DNA片段, 因此细胞中绝大多数表达的基因至少有两个酶切位点, 即产生一个两端带有可识别和处理的末端片段, 可以进行后续的扩增、消减、富集等操作。
在对心血管疾病的研究中, 如内皮细胞, 动脉硬化斑块等, 也有RDA技术的应用。Tyson 等应用RDA方法研究正常人和动脉粥样硬化患者血管中基因表达差异, 发现了包括炎症反应、免疫反应的相关基因在内的31个差异表达的基因, 为粥样硬化形成机理的免疫反应学说提供证据。 （四）蛋白质组学方法
蛋白质组（proteome）指一个细胞或一种组织基因组所表达的全部蛋白质。是由 Wilkins 在 1994 年首先提出, 并于 1995 年首次在文献中阐述。蛋白质组学方法是通过对比正常细胞与不同处理条件下的细胞或疾病细胞蛋白质表达谱的不同, 发现不同情况下蛋白质表达的变化, 是一种在蛋白质水平的差异显示。
该技术基本方法为: ①样品制备; ②蛋白质的分离, 常用分离方法有双向凝胶电泳（2- DE）、离子交换、分子筛法、高效液相色谱法（HPLC）、毛细管电泳、质谱（MS）等技术; ③蛋白质成像; ④蛋白质的鉴定: 在分离及检测之后, 要进行蛋白质鉴定。
蛋白质组学技术在心血管疾病研究中广泛应用。研究者已在心血管蛋白质组研究中识别了能量代谢相关蛋白、细胞骨架蛋白、热休克蛋白等多种蛋白质的变化。
在扩张型心肌病的分子机制方面, 已发现近100 种心肌在扩张型心肌病的心肌中蛋白质明显减少, 大致分为三类: 细胞骨架及肌纤维蛋白, 与线粒体及能量产生相关的蛋白, 与应激反应相关蛋白。
在对心血管疾病中平滑肌细胞机能紊乱的研究中, 也有蛋白质组学方法的应用。Dupont 等用2- D 方法研究动脉平滑肌细胞, 发现患者中有 83个细胞内蛋白、18 个分泌蛋白表达不同。Mayr 等应用 2- D 与 MS 研究 PKC delta 对血管平滑肌细胞的作用, 结果 PKC 缺少的细胞中有 30 种以上的蛋白质改变, 包括涉及葡萄糖代谢、脂代谢的酶,及谷光甘肽循环、细胞骨架相关蛋白。证明 PKC delta 在葡萄糖代谢、脂代谢、控制细胞氧化还原态、SMC 细胞分化的过程中是关键调节因素。
在基因表达分析方法中, 没有一种方法能够适合于所有要研究的问题, 需要根据所研究问题的特点, 选择不同的方法, 也可以将几种方法结合使用。上文中的几种技术都有自己的缺点, 包括成本问题、灵敏度问题、操作复杂等。具体实验中还需根据不同目的、不同实验许可条件进行选择。另外, 新技术的出现往往会带来科学研究的巨大进展, PCR 技术就是一个很好的例证, 因此, 发展新技术也是科学研究中一个不可忽视的重要方向。 （五）第二代测序技术的发展
随着二十世纪中期 DNA 双螺旋结构的发现，至今生命科学可谓是在半个世
分子生物学技术
